МЕТОДИ НА АНАЛИЗ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АЗОТ И АЗОТНИ АГЕНТНИ СЪСТАВКИ В ХРАНИТЕ
Налда Ромеро
ОБЩИ МЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АЗОТ
1. Метод на Келдал
Характеризира се с използването на кипяща, концентрирана сярна киселина, която влияе на окислителното разрушаване на органичното вещество на пробата и редукцията на органичен азот до амоняк. Амонийът се задържа като амониев бисулфат и може да бъде определен на място или чрез алкална дестилация и титруване.
Химически и практически трудности
Количествено превръщане на азота в амоняк.
Корозивно действие на сярна киселина върху системата за отвеждане на дим.
Съображения за околната среда по отношение на изпускането на дим и замърсяването на водата с метални катализатори.
Увеличете съотношението калиев сулфат/сярна киселина (1 g. 1 m1) t ° 370-410 ° C.
Използване на метални катализатори.
Използване на H2O2.
Използвани метални катализатори
да се) Живачен оксид
Натиснете възстановяване на азот
Недостатъци
Токсичен.
Висока цена.
Замърсяване на водите.
Образуване на стабилно съединение с амоняк, което трябва да се разложи с добавяне на натриев тиосулфат.
б) Смес от селен или мед и селен сулфат
Селенът може да причини загуба на азот.
° С) Смес от меден сулфат и титанов диоксид
Полезно при анализ на зърнени култури.
Мащабна употреба като рутина.
По-малко ефективен при възстановяване на азот.
Определяне на амония
Амонякът в смилателя може да се определи по различни методи:
- Добавяне на излишък от алкали към храносмилателя, амонячна дестилация и титруване.
- Алкална смес от фенол с натриев хипохлорит, която дава синьо оцветяване с амоняк.
- Алкална смес от натриев салицилат, натриев нитропрусид и натриев хипохлорит, която дава ярко изумрудено зелено оцветяване с амоняк.
- Електрометрично определяне с използване на специфичен йонен електрод и 1% разтвор на натриев хидроксид .
Предимства на метода на Kjeldhal
Подходящ за различни видове продукти.
Висока надеждност.
Използва се като референтен метод.
Недостатъци на метода на Kjeldhal
Небелтъчните азотни съединения пречат.
Използване на токсични или скъпи катализатори.
Избор на коефициент на преобразуване.
две. Метод на Дюма
Характеризира се с пълна пиролиза на пробата и измерване на съдържанието на азот в димните газове.
Азотът може да се измери с манометър след абсорбиране на въглероден диоксид в алкален разтвор или чрез топлопроводимост при автоматизирани методи.
Той показва задоволителни еквивалентности в сравнение с метода на Kjeldahl при анализ на фуражи и бебешки храни, макар и с малко по-високи стойности.
Недостатъци
Включва неорганичен азот.
Изискват малки количества проба 5-50 mg, фино разделени и хомогенни, за да се сведе до минимум грешката при вземане на проби.
Този метод не може да се приложи върху мокър материал, така че трябва да се извърши предварително изсушаване.
3. Радиохимични методи
Описани са два метода:
да се) Неутронно активиране
Тежко количество проба се облъчва с неутрони, което причинява преминаването от 14 N до 13 N. Този позитрон има период на полуразпад 10 минути и излъчва гама лъчение, което се записва в сцинтилационен брояч. Броят е свързан със съдържанието на азот в пробата.
Обикновено; Бързо.
Няма проблеми със замърсяването.
Намерените стойности присъстват
добра корелация с метода
Келдал.
Цената на инфраструктурата е много висока.
б) Активиране на протони
Подобно на предишния с варианта, че пробата се облъчва с протони и се извършва преобразуването на 14 N до 14 O, изотоп, който се разпада с излъчването на протон и гама лъчение, които са регистрирани и свързани със съдържанието от пробата азот.
МЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПРОТЕИНИ
Има няколко алтернативни метода за определяне на протеини:
1. Използване на конверсионния коефициент
а) Определете общото съдържание на азот и умножете по коефициент на конверсия на азот в протеин. Този фактор се изчислява, като се вземе предвид процентът азот, който протеинът съдържа в храната.
Недостатъци на използването на фактора преобразуване:
За целите на изчислението се взема предвид съдържанието на азот в основния протеин, а не в цялата смес.
Анализираната фракция не е непременно чист протеин.
Непратеинови азотни корекции не се правят.
Предложено е да се определи коефициентът на конверсия на азот в протеин, като се използва аминокиселинният състав на храната, която се анализира, което е сложно при комбинирането на храните, за които се предпочита да продължи с използването на традиционни фактори, като информира на свой ред използван фактор.
б) Определете съдържанието на белтъчен азот и умножете по коефициент на конверсия на азот в протеин.
Използвани са различни методи за отделяне на протеини от непротеинови азотни съединения, сред които са отбелязани:
диализа и ултрафилтрация чрез мембрана;
топлинна коагулация (не е ефективно за казеин и желатин);
Недостатъци
Различия в протеиновите фракции, получени по различните методи. Трябва да се имат предвид възможни задържания върху протеина, утаен от малки непротеинови молекули чрез адсорбция или йонен обмен. Въпроси, свързани с използването на фактора за превръщане на азот в протеин.
2. Химични методи
Протеините имат широк спектър от химическо поведение поради свойството на аминокиселините да имат различни видове функционални групи, на химичните реакции на тези групи и на пептидните връзки.
Съображения при прилагането на химични методи:
се очаква добра корелация между тези два вида определяне на протеини, когато съотношението на протеини N/протеин N е ниско и постоянно; Y.
са задоволителни за млякото и зърнените култури и незадоволителни за повечето зеленчуци и хранителни смеси.
а) Метод на Биурет
Химичен принцип
Реакцията се характеризира с лилав оттенък, когато медни йони се комплексират от пептидни връзки при алкално рН. Отенъкът на цвета зависи от вида на протеина, а интензивността му зависи от съдържанието на протеин.
Използван реагент
Алкален разтвор, съдържащ медни йони, комплексирани с натриев и калиев тартарат.
550 nm, при 263 nm чувствителността се увеличава 10 пъти.
Намерено е малко приложение в анализа на храната поради наличието на интерференции като редуциращи захари, които намаляват медния йон в алкална среда, което води до незадоволителни резултати. Пример: мляко.
б) метод "свързване с багрило"
Химичен принцип
Характеризира се с образуването на оцветен и неразтворим продукт на протеинов съсирек от реакцията на протеина с оцветен разтвор на сулфонова киселина при pH 2. Оцветеният анион се свързва чрез електростатични асоциации към основните места на протеина, например към М-амино групи от лизин, аргинин гуанидин, хистидин имидазол и крайни амини. В допълнение, междумолекулните атракции се получават чрез хидрофобни взаимодействия между протеина и нейоногенната половина на аниона и между аниона, свързан с протеина, и нейоновата половина на аниона в разтвор.
Съсирекът се филтрира и излишното багрило в супернатанта се измерва колориметрично. Тази мярка е свързана със съдържанието на протеин.
Съображения
Методът е емпиричен, така че трябва да се намери идеалната концентрация на багрилото, която насища протеина и образува съсирек, но не губи чувствителност.
Полезно при рутинен анализ на подобни проби.
Евтино и бързо.
Точен като метода на Kjeldhal.
Използва се като референтен метод.
Недостатъци
Трудност при намирането на чисти тинктури.
Неравномерност в качеството на багрилата от една производствена партида в друга, като по този начин се изисква калибриране на метода с всяка партида.
Не е приложимо за храни, които променят съдържанието си в аминогрупи (протеолиза, потъмняване).
° С) Метод на алкална дестилация
Хидролизата на амиди в силна алкална среда води до амоняк, който се дестилира и стойността му е свързана със съдържанието на протеин.
Установено е, че добивът на амоняк е силно възпроизводим за даден протеин.
д) Метод на Лоури
Когато реактивът на Фолин се добави към протеин, той се редуцира до син молибденов комплекс чрез окисляване на аминокиселините тирозин, триптофан, цистин, цистерна и хистидин.
Висока чувствителност и лесен за работа.
Недостатъци
Цветовата реакция варира в зависимост от вида на протеина.
Интензивността на цвета не е строго пропорционална на концентрацията на протеин.
Калият, магнезият, EDTA и въглехидратните йони пречат на реакцията.
д) Метод за титруване на формалин
Излишъкът на формалдехид се добавя към алкално неутрализираната проба, която реагира с всяка основна група лизин и аргинин. Излишъкът от формалдехид се неутрализира с излишък от стандартна алкала, която се титрува и е свързана със съдържанието на протеин.
Неговата възпроизводимост е по-ниска от тази на други алтернативни методи.
3. Физически методи
Съображения
Те са по-прости, по-бързи и цената на анализ е по-ниска, въпреки че цената на оборудването е висока. Точността на тези методи е свързана с характеристиките на материала, който се анализира. Съгласието с общия азот зависи от материала, който не се различава от пробата до пробата.
да се) Инфрачервена спектроскопия
Той се възползва от абсорбцията на амидната група на пептидната връзка при 6,46 Tm.
Бърз, многокомпонентен анализ Неразрушаващ.
Недостатъци
Пречи на водата.
Комплексен процес на калибриране.
б) Отразяваща инфрачервена спектроскопия
Пробата се осветява с шест дължини на вълната, близки до инфрачервеното лъчение (0.75-2.5 Tm) и се открива отразена светлина.
Съображение
Необходимо е калибриране спрямо набор от статистически значими проби, анализирани чрез традиционни референтни методи.
Бърз, многокомпонентен анализ. Приложимо за твърди материали. Количествено определя протеина в присъствието на вода.
Недостатъци
Нишестета и липидите пречат.
Изместване на спектъра на отражение поради влагата, съдържаща се в частиците.
Комплексен процес на калибриране.
в) Ултравиолетова спектрофотометрия
Измерва протеини в разтвор с максимална абсорбция при 280 nm, приписвана на ароматните пръстени на тирозин и триптофан и между 180-220 nm.
Бързо, неразрушаващо.
Полезно за наблюдение на елуенти върху хроматографски колони.
Интерференция от други съединения (нуклеинови киселини, нуклеотиди).
д) Рефрактометрични методи
Измерва директната рефракция на протеина в разтвор или промяната в индекса на рефракция, причинена от отстраняването на протеина от разтвора.
и) Турбидиметричен метод
Измерва намаляването на интензивността на светлината при преминаване през суспензия от протеинови частици. Тази промяна е свързана със съдържанието на протеин.
Е) Електронна спектроскопия
Облъчване на материала с рентгенови лъчи и количествено определяне на освободените фотоелектрони, характерни за N атома на амидната група на протеина.
Добра корелация с общото съдържание на N.
Други групи от интерес (сулфидни групи аминокиселини) могат да бъдат определени едновременно.
ж) полярография
Определя следи от протеин.
МЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АМИНО КИСЕЛИНИ
Аминокиселините представляват основната структура на протеина и придават хранителна стойност на храната.
За анализ на аминокиселини е необходимо да се разкъсат пептидните връзки на протеините посредством хидролиза, която може да бъде кисела, алкална или ензимна. Киселинната хидролиза се извършва със солна киселина с концентрация 6N. Реактивът трябва да е чист и да не оставя остатъци, затова се препоръчва хидролиза в газовата фаза. За да бъде хидролизата на протеините пълна, е необходимо да се вземат предвид фактори като съотношението киселина/протеин, температурата и времето на хидролиза и да се избягва присъствието на кислород в средата чрез прилагане на вакуум и азот, за да се сведе до минимум окисляването на аминокиселини.
Съображения за киселинна хидролиза
Киселинната хидролиза засяга структурата на някои аминокиселини, като:
- Частично унищожаване на треонин, серин, цистин, цистерна, метионин и тирозин.
Разрушаването на цистин, цистеин и метионин се предотвратява чрез първо окисляване на пробата с експресна киселина и вместо това се определят цистеинова киселина и метионин сулфон.
Триптофанът е напълно унищожен от солна киселина, така че за определянето му е необходимо да се извърши алкална хидролиза. - Превръщане на: тирозин в хлорно производно; аспарагин до аспарагинова киселина; и глутамин към глутаминова киселина.
- Бавно освобождаване на изолевцин и валин.
За да се компенсират загубите, произведени в аминокиселини и също така да се определи количествено наличните аминокиселини, към пробата може да се добави известно количество вътрешен стандарт, което може да бъде 2-аминомаслена киселина преди хидролиза.
Свободните аминокиселини се дериватизират чрез предколонни или следколонни методи и се разделят с помощта на йонообменна хроматография, високоефективна течна хроматография или газо-течна хроматография.
Изисквания за дериватизация на предколона: