Субекти

Обобщение

Въведение

В допълнение към основната си роля като градивен елемент за синтеза на протеини и растежа на животните, метионинът се оказа ключов фактор за контролиране на окислителното състояние 7, 8. Всъщност метиониновите остатъци в протеините лесно реагират с различни реактивни кислородни форми (ROS), за да образуват метионин сулфоксид (MetO), а MetO редуктазите катализират зависимо от тиоредоксин редукция на MetO до метионин in vivo. Следователно това циклично взаимно преобразуване на протеинови метионинови остатъци между окислени и редуцирани форми може да се разглежда като ефективен механизъм за отстраняване на ROS 9, 10. Освен това, метионинът захранва трансулфуризационния път, който води до синтеза на други сярни аминокиселини, по-специално цистеин 11, 12. Цистеинът е необходим за синтеза на глутатион (GSH) и таурин, два компонента, които имат способността да влияят на клетъчното редокс състояние и следователно са от съществено значение за защитата на гостоприемника срещу оксидативен стрес 13, 14, 15, 16 . По този начин метионинът играе ключова роля в защитата срещу оксидативен стрес.

Настоящото проучване е проведено с цел изясняване на ефекта от диетичния дефицит на метионин върху контрола на чернодробното окислително състояние и за идентифициране на основните механизми в дъговата пъстърва (Oncorhynchus mykiss).

Материали и методи

Експериментите са проведени в съответствие с правната рамка на Франция и ЕС. Те спазват директивата 2010/63/ЕС за защита на животните, използвани за научни цели, както и декрет № 2013-118 от 1 февруари 2013 г. на френското законодателство, което регулира етичното отношение към животните. Протоколът е одобрен от Френския национален консултативен комитет по етика под референтен номер APAFIS8222-2017041016141425-v4.

Изпитание за хранене и разплод.

Таблица в пълен размер

Индивидуалната телесна маса, дневният темп на растеж, дневният прием на храна и ефективността на фуражите са изчислени, както е описано по-горе 24 .

В края на 6-седмичното изпитване за хранене, кръв и черен дроб бяха взети от 3 риби на резервоар, обезболени с бензокаин (30 mg/L) и заклани чрез силен удар в главата. Кръвни проби се събират 16 часа след последното хранене на опашната вена в хепаринизирани спринцовки и се центрофугират (3000 g, 5 минути); Възстановената плазма незабавно се замразява и се поддържа при -20 ° C. Черният дроб се събира на 2 h, 4 h и 16 h след последното хранене, дисектира се, претегля се и незабавно се замразява в течен азот и се поддържа при -80 ° C.

Химичен състав на диетите.

DM, суровите мазнини и съдържанието на сурова енергия в диетите се определят, следвайки процедурите, описани по-горе 24. Съдържанието на суров протеин беше измерено като N × 6,25 по метода на Kjeldahl след разграждане на киселина (ISO 937: 1978) и с помощта на анализатора Leco FP-2000 (Leco Corp., St. Joseph, MI). Съдържанието на нишесте се измерва по ензимен метод (InVivo Labs). Концентрациите на аминокиселини в диетата са направени чрез мокра химия в лабораторията Evonik-Degussa (Ханау, Германия) чрез йонообменна хроматография с дериватизация след колона с нинхидрин. Аминокиселините се окисляват с перформатична киселина, която се неутрализира с натриев метабисулфит 25; Директива на Комисията от 1998 г.). Аминокиселините се освобождават от протеина чрез хидролиза с 6N HCl за 24 часа при 110 ° C и се определят количествено с метода на вътрешния стандарт чрез измерване на абсорбцията на реакционните продукти с нинхидрин при 570 nm.

Ниво на плазмен метионин.

Концентрациите на свободен метионин в кръвната плазма се определят чрез йонообменна хроматография с помощта на анализатор на аминокиселини Biochrom 20, литиева колона и литиеви буфери 26, 27 .

Western blot анализ

Чернодробни проби 2 и 16 часа след последното хранене се хомогенизират и анализират съгласно протокол 24, подробно описан по-горе и като се използват следните антитела: антифосфорофозомен протеин S6 киназа 1 (P-RPS6K1, Thr389, # 9205, Cell Signaling Technology); анти-RPS6K1 (# 9202, технология за клетъчна сигнализация); фосфо-EIF4EBP1, белтък, свързващ фактор за иницииране на еукариотния транслация 4E 1 (P-EIF4EBP1, Thr37/Thr46, # 9459, Cell Signaling Technology); анти-EIF4EBP1 (# 9452, технология за клетъчна сигнализация); анти-фосфо eIF2α (Ser51, # 9721, технология за клетъчна сигнализация); антикарбоксилен терминал eIF2α (# 9722, клетъчна сигнална технология); анти-фосфо AMP-активирана протеин киназа (P-AMPK, Thr172, # 2532, Cell Signaling Technology); анти-AMPK (# 2532, технология за клетъчна сигнализация); анти-β-тубулин (TUBB) (# 2146, клетъчна сигнална технология); anti-LC3B (# 2775, Технология за клетъчна сигнализация). Всички тези антитела вече са валидирани в дъгова пъстърва 24, 28 .

За да се оценят нивата на свързани с митохондриите протеини (TIMM23, митофузин2, PARKIN, фосфо-убиквитин (Ser65) и общ убиквитин), тъканите се хомогенизират чрез ултразвуково прекъсване в 9 обем студен буфер, съдържащ 50 mM Tris (рН 7.4). 5 mM EDTA, 1,4-дитиотреитол 2 mM и коктейл с инхибитор на протеаза (Sigma, St. Louis, MO; P-2714). След това хомогенатът се центрофугира и супернатантата се използва незабавно за Western blot анализ, както е описано по-горе и използвайки подходящите антитела: anti-TIMM23 (# 611222, BD Transduction Laboratories ™), анти-митофузин2 (Mfn2) (# ab56889, abcam), анти -PARKIN (# ab15954, abcam), анти-фосфо-убиквитин (Ser65) (Ser65, # ABS1513-I, EMD Millipore) и анти-общ убиквитин (# MAB1510, EMD Millipore). Преди използването на всяко антитяло, аминокиселинната последователност на целевия протеин се наблюдава в базата данни SIGENAE (//www.sigenae.org), за да се провери запазването на антигенната последователност със съответната последователност на бозайници, осигурявайки добра специфичност на бозайникови антитела, използвани при анализа на пробите.

Ензимна дейност

Черният дроб, събран 16 часа след храненето, се хомогенизира с грънчар при 4 ° С, в буфер, съдържащ 0,1 М триетаноламин, рН 7,3. Хомогенатът след това се използва за ензимни анализи. Концентрацията на протеин беше измерена по метода на Lowry.

Каталазната активност беше оценена с помощта на орограф на Oroboros. Каталазната активност на хомогенираните тъкани беше последвана от регистриране на производството на кислород в присъствието на 0,01% H2O2 и 1 µM антимицин, за да се избегне смущаваща консумация на кислород в митохондриите. Всички ензимни активности се изразяват като процент от контролното състояние, с изключение на каталазата, която се изразява като поток от O 2 pmol/s * ml * mg.

Количествен RT-PCR анализ

Количествени RT-PCR анализи бяха извършени в черния дроб на рибите, взети проби на 2 и 16 часа след последното хранене. Условията на протокола за подготовка на проби и количествена RT-PCR са публикувани преди това 28, 29. Праймерите, използвани за RT-PCR анализи в реално време, са изброени в Таблица 2. Праймерите за активатор на пролифератор на пероксизомен рецептор-γ коактиватор-1а са преработени с помощта на софтуера Primer3. За анализ на експресията се извърши относителното количествено определяне на експресията на целевия ген, използвайки ΔCT метода, описан от 30. Стойността на относителната генна експресия на еукариотния транслационен фактор на удължаване на транслацията 1 α 1 (eef1a1) е използвана за нормализиране на измерените експресионни стойности на таргетната иРНК и е установено, че тя не се променя значително с времето за вземане на проби или между диетични лечения (данните не са показани).

Таблица в пълен размер

Определяне на окислителното състояние.

Концентрациите на протеинови карбонили и глутатион са измерени в проби от черния дроб на черния дроб 16 часа след последното хранене (N = 6/диета). Пробите бяха подготвени и анализирани за протеинови карбонилини съгласно протокола на производителя (Millipore; Oxyblot Protein Oxyction Detection Kit S 7150). Количественото определяне на протеините се извършва със софтуера Odyssey, който изразява съотношението на протеини, получени към DNPH/β-тубулин (TUBB) от черния дроб.

Оксидираният глутатион (GSSG) и редуцираният глутатион (GSH) се измерват в хомогенати от рибен черен дроб, като се използва Cayman Glutathione Assay Kit (Bertin Pharma) в съответствие с инструкциите на производителя.

Определяне на митохондриална ДНК.

Изолирането на ДНК се извършва в проби от черен дроб на риба 16 часа след последното хранене (N = 6/диета), следвайки процедурите, описани по-рано в Liu et al. 31. Броят на mtDNA копие се определя чрез количествена PCR.Обитостта на гени се открива, както е описано по-горе в количествената RT-PCR секция. mtDNA номер на копие (кодирана в митохондрии левцин tRNA 1 UUA/G: Праймер праймер: AAAACAGACAAGGGGGCCA, Обратен праймер: AGGGTGAGGAAAGCAACTGC) беше нормализиран до Beta-2-макроглобулин геномна ДНК в пробата (Препратка Primer: TCATCGGTGCCCCATCverseCGCTCCAT TCATCGCTACCATAGGTG Праймерите за гените MT-TL1 и бета 2 М бяха преработени със софтуера Primer3 и получените ампликони бяха пречистени и секвенирани (Beckman-Coulter Genomics, Takeley, UK).

Електронен микроскоп

За електронна микроскопия пресните чернодробни блокове, взети проби 4 часа след последното хранене (1 mm 3) (N = 3/диета) бяха анализирани с 2,5% глутаралдехид в 0,1 М фосфатен буфер (рН 7,4) и впоследствие бяха определени на 1%. Осмиев тетроксид във фосфатен буфер. Условията както на обработките с ултра тънък разрез, така и на наблюденията вече са описани в Seiliez et al. 28 .

Статистически анализ

Данните са изразени като средни стойности ± SEM. Нормалността беше оценена с помощта на теста на Шаприо, докато равенството на дисперсиите беше определено с помощта на теста на Левен. Когато се спазваха нормалността и/или еднакви отклонения на данните, тестът на Student беше използван за сравнение на данните между диетата CTL, хранена с риба, и диетата MD, хранена с риба. За разлика от това, когато данните не отговарят на предположенията за еднаква нормалност и/или дисперсии, за сравнение на данните от двете групи се използва тестът на Wilcoxon. Статистически анализи на нивата на иРНК на гените Asns и ddit3 бяха извършени с помощта на двупосочен ANOVA. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на софтуера R. За всички статистически анализи нивото на значимост беше установено в P

храната

Дефицитът на метионин няма влияние върху нивата на антиоксидантната защитна тРНК на ( ДА СЕ ) супероксид дисмутаза 1 (sod1), ( Б. ) супероксид дисмутаза 2 (sod2), ( ° С ) глутатион-S-трансфераза π (gstπ) и ( д ) глутатион дисулфид редуктаза (gsr) беше измерена с помощта на количествени RT-qPCR анализи в реално време в пъстърва (CTL) или диета с дефицит на метионин (MD) и проби бяха взети 16 часа след последното хранене. Стойностите на експресията се нормализират с иРНК на еукариотния транслационен коефициент на удължаване 1 α 1 (eef1a1). Каталазна активност ( И ) се измерва с оксиграф 16 часа след последното хранене. Стойностите са средни (n = 6), със стандартна грешка на средната стойност, представена от вертикални ленти. * се използва, за да се посочи значителна разлика между лечението между двете диетични групи (P

В заключение получените резултати показват, че храненето на дъгова пъстърва с диета с дефицит на метионин в продължение на 6 седмици води до спад в добивите, свързани както с общ митохондриален дефект, така и с намаляване на окислителното състояние в черния дроб. Получените резултати също разкриват силно нарастване на митофагията при тези условия и подчертават участието на оста PINK1/PARKIN в това събитие. Доколкото ни е известно, малко или нищо не е било отдадено на хранителната регулация на митофагията и свързаните механизми все още са далеч от разбирането и си струва да бъдат проучени. От практическа гледна точка на аквакултурите ние демонстрираме, че наличието на метионин в храната е от съществено значение за целостта на митохондриите и може да бъде начин да се разбере спадът на растежа на рибите, хранени с диета с МД. В бъдеще друга важна тема ще бъде разбирането как дефицитът на метионин влияе върху целостта на митохондриите.

Израз на благодарност

Авторите признават институционалните фондове на EVONIK Industries и INRA за финансиране на това проучване и Националната агенция за научни изследвания и технологии (ANRT; Франция) за безвъзмездната финансова помощ (CIFRE PhD Research Grant). Специална благодарност на всички членове на Club d'Autophagie Bordelais (CAB) за полезни дискусии и предложения, на Karine Dias, V. Véron, A. Surget и A. Hermann (INRA St Pée-sur-Nivelle) за тяхното съдействие техника и технически персонал на рибното стопанство (F. Vallée, F. Terrier, A. Lanuque, F. Sandres).