ОЦЕНКА НА ДЕЙНОСТТА НА ЕТЕРИЧНИ МАСЛЕНИ КОМПОНЕНТИ НА КОЛУМБИЙСКИ РАСТЕНИЯ СРЕЩУ Trypanosoma cruzi и Leishmania spp LAURA VIVIANA HERRERA SANDOVAL UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER ЗДРАВЕН ФАКУЛТЕТ МАЕСТРИА В ОСНОВНИ НАУКИ 2011

етерични

ОЦЕНКА НА ДЕЙНОСТТА НА ЕТЕРИЧНИ МАСЛЕНИ КОМПОНЕНТИ НА КОЛУМБИЙСКИ РАСТЕНИЯ СРЕЩУ Trypanosoma cruzi и Leishmania spp LAURA VIVIANA HERRERA SANDOVAL Дипломната работа е представена като изискване за званието: МАГИСТЪР В ОСНОВНИ БИОМЕДИЦИНСКИ НАУКИ, РАБОТА НА МАКСИЧЕСКИ ДАННИ. UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER ФАКУЛТЕТ ПО ЗДРАВЕОПАЗВАНЕ В ОСНОВНИ БИОМЕДИЦИНСКИ НАУКИ BUCARAMANGA 2011 2

ПОСВЕТЕНИЕ Ако ухото ви е наклонено към мъдрост и сърцето ви се предаде на интелигентността; ако се обадите на разузнаването и поискате проницателност; Ако го търсите като сребро, като скрито съкровище, тогава ще разберете страха от Господа и ще намерите Божието познание. Защото Господ дава мъдрост; знания и знания текат от устните му Притчи 2: 2-6 Към Бога, Който може всичко. 6

ПРИЗНАВАНИЯ На моя преподавател, д-р Патриша Ескобар за нейното огромно сътрудничество, насоки, подкрепа и преди всичко търпение през целия ми процес на обучение и развитие на тази работа. На д-р Елена Сташенко и нейната работна група CENIVAM: Камило, Деянира и Уилям за предоставената информация и техническа подкрепа. НА COLCIENCIAS за финансиране на тази работа чрез Изследователския център за върхови постижения на CENIVAM (CO № 432-Colciencias). На колегите в лабораторията по химиотерапия, особено на Сандра Леал за нейната техническа и научна подкрепа. На всички хора: семейство, приятели, колеги и учители, които по един или друг начин са допринесли за изпълнението на тази работа. 7

СЪДЪРЖАНИЕ Страница ВЪВЕДЕНИЕ. 17 1. ИЗЯВЛЕНИЕ НА ПРОБЛЕМА. 20 2 ОБОСНОВКА. 22 3 ВЪПРОС ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ. 24 4. ТЕОРЕТИЧНА РАМКА. 25 4.1 Болест на Шагас. 25 4.1.1 Общи положения. 25 4.1.2 Паразитът 27 4.1.3 Лечение. 27 4.2 ЛЕЙШМАНИАЗИС. 30 4.2.1 Общи положения. 30 4.2.2 Паразитът. 32 4.2.3 Лечение. 33 4.3 ЕТЕРИЧНИ МАСЛА (ES) И НЕГОВИТЕ КОМПОНЕНТИ. 38 4.3.1 Общи положения. 38 4.3.2 Химичен състав. 38 4.3.3 Биологична активност. 42 5. СЪСТОЯНИЕ НА ИЗКУСТВОТО. 44 6. ЦЕЛИ. 47 6.1 Обща цел. 47 6.2 Специфични цели. 47 7. МЕТОДОЛОГИЯ. 48 10

7.1 Методологичен дизайн. 48 7.2 Етерични масла (EA). 48 7.2.1 Събиране, характеризиране и композиция. 48 7.2.2 Избор на AE. 49 7.3 Основни компоненти на използваните ЕА. 55 7.4 Референтни лекарства. 59 7.5 Подготовка на състав и работни разтвори. 59 7.6 Паразити и клетки от бозайници. 59 7.7 Тест за токсичност на клетъчни бозайници. 60 7.8 Тестове за активност в T. cruzi. 60 7.8.1 Активност в извънклетъчни форми. 60 7.8.2 Активност във вътреклетъчни амастиготи. 61 7.9 Изпитания за активност в Лайшмания. 61 7.9.1 Активност в извънклетъчни форми. 61 7.9.2 Активност във вътреклетъчни амастиготи. 61 7.10 Анализ на резултатите. 62 8. РЕЗУЛТАТИ. 72 8.1 Резултати при избора на компоненти и EA. 72 8.2 Активност на компонентите в клетките на бозайници. 74 8.3 Активност в T. cruzi. 76 8.3.1 Дейност на компонентите. 76 8.3.2 Дейност на компонентите по отношение на Nifurtimox. 76 8.3.3 Активност на компонентите в T. cruzi срещу Vero клетки. 77 8.4 Дейност в Лейшмания. 79 11

8.4.1 Дейност на компонентите. 79 8.4.2 Дейност на референтното лекарство. 79 8.4.3 Връзка на активността на Leishmania спрямо THP-1 клетки. 80 8.5 Сравнение на активността на компонентите при T. cruzi и L. chagasi. 83 8.6 Връзка на активността на компонента спрямо ЕА, която го съдържа: индекс на активност (IA). 83 8.7 Хемо-компютърен анализ на активни компоненти. 89 9. ДИСКУСИЯ. 91 10. ЗАКЛЮЧЕНИЯ. 98 11. БИБЛИОГРАФИЯ. 101 12

СПИСЪК НА ФИГУРИТЕ Страница Фигура 1. Паразитни форми на рода Trypanosoma 28 Фигура 2. Жизнен цикъл на Trypanosoma Cruzi 30 Фигура 3. Жизнен цикъл на рода Leishmania 35 Фигура 4. Примери за химични структури на ароматни компоненти на етерични масла 40 Фигура 5. Примери за химични структури на AE терпени 41 Фигура 6: Примери за химични структури на AE сесквитерпени 41 Фигура 7. Методологичен дизайн, приложен в първата фаза на изследването 50 Фигура 8. Методологичен дизайн, приложен във втората фаза на изследването 51 Фигура 9. Относително количество избрани компоненти на етерични масла от рода Lippia 73 Фигура 10. Относително количество избрани компоненти на етерични масла от рода Piper 74 13

СПИСЪК НА ТАБЛИЦИТЕ Страница Таблица 1. Таксономична класификация на рода Leishmania 34 Таблица 2. Изследвания на активността на AE и неговите основни компоненти срещу вида Leishmania и T. cruzi 46 Таблица 3. Брой на AE според тяхната антипаразитна активност 49 Таблица 4. Семейства най-чести AE активни в T. cruzi и L. chagasi 52 Таблица 5. Активни етерично-маслени родове в T. cruzi и L. chagasi 52 Таблица 6. Идентифициране на AE на ароматни растения, избрани в изследването и активни в T. cruzi и L chagasi 54 Таблица 7. Химични характеристики на избрани активни компоненти на етерично масло 56 Таблица 8. Критерии за класификация на In vitro активността на съединенията 63 Таблица 9. Химичен състав на AE от рода Lippia 64 Таблица 10. Химичен състав на AE на Genus Tagetes 66 Таблица 11. Химичен състав на AE на рода Piper 68 Таблица 12. Компонентна активност в клетки от бозайници 75 Таблица 13. Компонентна активност в T. Cruzi 78 14

Таблица 14. Активност на компонентите в L. chagasi 81 Таблица 15. Активност на компонентите в L. Panamensis 82 Таблица 16. Индекси на активност на апинен 85 Таблица 17. Индекси на активност на Carvacrol 86 Таблица 18. Индекси на активност на тимол 87 Таблица 19. Индекси на активността на Транс-β-кариофилен 88 Таблица 20. Прогнозиране на риска от токсичност на изследвани компоненти 90 Таблица 21. Анализ на биологичната активност на компонентите на етеричните масла, оценени в настоящото проучване 100 15

СПИСЪК НА СЪКРАЩЕНИЯТА AE Етерични масла AmB Амфотерицин B CC 50 Цитотоксична концентрация 50 CC 90 Цитотоксична концентрация 90 CI 50 Инхибиторна концентрация 50 CI 90 Инхибиторна концентрация 90 CENIVAM Национален изследователски център за агроиндустриализация на тропически лечебни ароматни растителни видове DE Стандартно отклонение DMSO Диметилсулфоксид I Индекс IS активност Индекс на селективност LC Кожна лайшманиоза LV Висцерална лайшманиоза MTT (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2-дифенилтетразолиев бромид) NC Не се изчислява ND Не се определя NFX Nifurtimox NT Нетоксичен PBS Фосфатен буфер физиологичен разтвор PMA Phorbol миристат ацетат 16

активност при паразити. За да се сравни активността на компонента с тази на ЕА, която го съдържа, се изчислява Индексът на активност (АИ), дефиниран като съотношение на активността на ЕА при паразити и активността на компонента в клетките. Компонентите бяха класифицирани според критериите за активност и бяха проведени статистически тестове, за да се установят значителните разлики в тяхната активност по отношение на: вида на съединенията, вида на паразитите и начина на живот (свободен или вътреклетъчен), вида на клетките и референтното лекарство, p стойностите