Статии

ОСНОВНИ ЕСПЕРМАТИЧНИ КРИИОБИОЛОГИИ ЗА СЕМЕННИ БАНКИ

Ана Фернандес 1, Мария дел Кармен Гонзалво 1 Ана Клаверо 1, Рафаел Руис де Асин 1, Сандра Замора 1, Мария Ролдан 1, Белен Рабело 1, Хуан Пабло Рамирес 2,3 Алберто Йолди 2, Хосе Антонио Кастилия 1,2,3
1 Отдел за човешка репродукция, Университетска болница „Virgen de las Nieves“, Гранада.
2 CEIFER Semen Bank, Гранада.
3 Програма за външен контрол на качеството за репродуктивната лаборатория на Асоциацията за изследване на биологията на репродукцията (ASEBIR), Мадрид.

основи

Публикувано в списанието на 14 юни 2009 г.

Резюме: Сперматозоидите имат специални характеристики за замразяване, в тази работа се анализират тези характеристики и тяхното влияние върху оцеляването на сперматозоидите, приложени върху спермата. Сред тях са фактори, специфични за типа клетка, която трябва да бъде замразена, и фактори, зависими от протокола за замразяване. Сред първите можем да говорим за размера и пропускливостта на клетките, а сред вторите откриваме кривата на замръзване и добавянето на криопротектори.

Кривата на замръзване се отнася до клетъчната реакция на замръзване (студен удар, заледяване и размразяване), която може да причини криоиндуцирани лезии като вътреклетъчно образуване на лед, осмотичен стрес или рекристализация. За да се избегнат тези увреждания, всички протоколи описват като основна част пристрастяването към полезни криопротективни агенти за оцеляване на клетките, въпреки че включват и вредни аспекти като тяхната токсичност. Накрая ще бъдат анализирани основите и ролята на витрификацията на сперматозоидите в спермата.

Ключови думи: сперма, криобиология, витрификация

БАЗИ НА КРИОБИОЛОГИЯТА НА СПЕРМА, ПРИЛОЖЕНА ЗА СПЕРМНИ БАНКИ

Резюме: Сперматозоидите имат специални характеристики на замразяване, тези характеристики и влияния върху оцеляването на спермата, приложени към банките на сперматозоиди, са анализирани в тази работа. Сред тях намираме конкретни фактори на замръзване в зависимост от клетъчния тип и протокола за замразяване. Сред тези ще започнем с размера и клетъчната пропускливост и второ ще разгледаме кривата на замръзване и добавянето на криопротектори.

Кривата на замръзване се отнася до клетъчната реакция на замръзване (студен удар, образуване на лед и размразяване), която може да провокира криотравми като вътреклетъчно образуване на лед, осмотичен стрес или рекристализация. За да се избегнат тези увреждания, всички протоколи като основна мярка описват добавянето на криозащитни агенти като полезно за оцеляването на клетката, въпреки че те също причиняват вредни аспекти поради тяхната токсичност. Накрая ще бъдат анализирани основите и ролята на витрификацията на сперматозоидите в сперматозоидите.

Ключови думи: банка на сперматозоиди, криобиология, витрификация

ВЪВЕДЕНИЕ

Основната цел на криоконсервацията на сперматозоидите е да поддържа тяхната жизнеспособност и функционалност при ниски температури за дълги периоди от време. Криоконсервираните клетки се съхраняват при -196 ° C в течен азот. При тази температура няма дифузионни явления или достатъчно топлинна енергия за провеждане на химични реакции. Следователно трудностите при замразяването не произтичат от престоя при ниски температури, а от процесите на охлаждане и отопление.

По време на тези процеси клетките са в суспензия във воден разтвор. Споменатият разтвор ще има колигативни свойства, които основно зависят от броя на молекулите в него, а не от тяхната природа. По този начин добавянето на разтворено вещество към разтвор намалява точката на замръзване (криоскопска точка) и налягането на парите и увеличава осмотичното налягане и точката на кипене. Осмозата е движение на вода от разтвори с ниска концентрация на разтворено вещество към разтвори с висока концентрация на разтворено вещество, а осмотичното налягане е хидростатичното налягане, което се генерира през полупропусклива мембрана с градиент на концентрация. Тези свойства трябва да се имат предвид, когато при понижаване на температурата по време на процеса на замразяване в извънклетъчната среда започне да се образува лед, тъй като водата, която е част от леда, не съдържа разтворените разтворени вещества, увеличавайки концентрацията им в извънклетъчната среда (хиперосмотичен) и модифициране на колигативните свойства на това.

По време на тези процеси клетките се държат като осмометри, променяйки обема си в отговор на извънклетъчните осмотични промени, като по този начин клетките губят или улавят вода в зависимост от това дали са изложени на хипер или хипоосмотична извънклетъчна среда, съответно; движенията на вода и криопротектори през клетъчната мембрана по време на криоконсервация се управляват от различни биофизични параметри, които трябва да бъдат дефинирани за всеки тип клетки при различни температури и в крайна сметка ще бъдат отговорни за увреждане на клетките.

ОБЩИ КОНЦЕПЦИИ НА ТРАНСПОРТ ЧРЕЗ МЕМБРАНИ ПО ВРЕМЕ НА ЗАМРАЗЯВАНЕ И РАЗМРАЗЯВАНЕ

Като пример можем да разгледаме клетката като „торбичка“, пълна с физиологичен разтвор, потопен в замразяваща среда (извънклетъчна среда). Опаковката на торбата, т.е. клетъчната мембрана, ще има полупропускливи мембранни свойства.

Двете основни характеристики, които ще определят поведението на мембраната, са: размер и пропускливост.

РАЗМЕР

Това е мембранната зона, достъпна за обмен на вода с външната среда.

ПОСТОЯННОСТ.

Този параметър определя лекотата, с която водата може да премине през мембраната при градиент на концентрация. Пропускливостта на клетъчната мембрана се регулира от закон, който отразява емпиричния факт, че колкото по-ниска е температурата на системата, толкова по-ниска е пропускливостта на мембраната. По този начин клетъчната мембрана губи своя полупропусклив характер, за да стане непропусклива, под определена критична температура. Когато охлаждаме системата под тази критична температура, процесът на дехидратация спира, което води до увеличаване на вероятността за образуване на вътреклетъчен лед. Лабораторните експерименти показват, че пропускливостта на клетъчната мембрана, освен че варира в зависимост от температурата на системата, зависи и от концентрацията на разтвореното вещество в извънклетъчната среда.

Съдържанието на "торбичката", т.е. вътреклетъчната среда, ще бъде съставено от два региона:

ОБЕМ ОСМОТИЧНО НЕАКТИВЕН

В този регион включваме вътрешни органели на клетката, клетъчното ядро, макромолекули като протеини и т.н. Те са вътрешни части на клетката, които няма да се намесват в процеса на воден транспорт. Определя се като водата, която никога няма да напусне вътрешността на клетката в отговор на увеличаване на концентрацията на разтворените вещества в извънклетъчното пространство, тъй като е свързана с макромолекули и вътреклетъчни структури. Ако клетката се дехидратира и намали нейния размер извън осмотично неактивния обем, нейната жизнеспособност може да бъде нарушена (хипотеза на Meryman за минимален обем, за да се обясни увреждането на клетките по време на замразяване) (Meryman, 1970).

ОСМОТИЧНО АКТИВЕН ОБЕМ

В този регион включваме вътреклетъчния разтвор, в който вътрешните органели, ядрото и т.н., се носят и които могат да напуснат клетката.

КЛЕТИЧЕН РЕАКЦИЯ НА ЗАМРАЗЯВАНЕ

ПОЩЕДИ ОТ СТУДЕН ШОК И ОХЛАЖДАНЕ (ОТ 37ºC ДО 0ºC)

Студеният шок е увреждане на клетките поради чувствителност към скоростта на охлаждане и се причинява от преходни ефекти в липидната фаза (Drobnis et al., 1993). Травмата с охлаждане е повреда поради чувствителност към определена температура или диапазон от температури.

Мастните киселини могат да съществуват в подредено твърдо състояние (гел) или в по-гъвкаво и относително неподредено състояние (течност). Преходът от едно състояние в друго се осъществява при диапазон от температури, средната стойност на които е известна като температура на фазовия преход ("температура на топене", Tm). Тази температура на преход ще бъде по-висока или по-ниска в зависимост от състава на мастните киселини на мембраната. Повечето мембрани на еукариотните клетки имат своя Tm между 0ºC и 20ºC.

Фазовият преход в плазмената мембрана не настъпва едновременно във всичките й фосфолипиди и следователно по време на прехода се очаква съжителството на домейни в течно състояние и домейни в гел състояние. Тази ситуация създава дефекти в опаковката на мембраните и е свързана с по-голяма пропускливост на разтворените вещества през нея. По този начин е показано, че при достигане на температурата на преход в даден двуслой, най-голямата загуба на разтворени вещества се получава през мембраната.

В допълнение, тази промяна причинява физически промени в плазмената мембрана поради индуцирането на липидни опаковки; преходните промени в липидната фаза причиняват нелинейни кинетични реакции в някои ензими, включително някои мембранни АТФази. Вероятно такива ефекти са отчасти отговорни за лошия контрол на клетъчната концентрация на калций, което е очевидно при температури под 17 ºC (Bailey et al., 1994).

Топлинният шок може да бъде смекчен от криозащитни агенти, наличието на определени фосфолипиди (фосфатидил серин), бавно замразяване и предварително кондициониране в среда с високо ниво на соли. Изглежда човешкият сперматозоид е малко засегнат от студен удар и смразяващи щети, вероятно благодарение на състава на неговата мембрана (Holt, 2000).

ЛЕДОФОРМАЦИЯ (0ºC до 2500ºC/min., Която може да образува вътреклетъчни ледени кристали и да причини увреждане на сперматозоидите. За да се увеличи скоростта на замръзване са използвани устройства, различни от класическата слама, които позволяват по-голям контакт между клетъчната суспензия и течния азот като решетки с електронна микроскопия, полусламки, криолуп, криотоп, криотип и криолиф (Fuller et al., 2004). Скоростите на охлаждане и нагряване могат да се увеличат съответно до 30 000 ° C/min и 42 000 ° C/min и по този начин успешно се избягва образуването на вътреклетъчен лед. За да се постигне тази висока скорост е необходимо обемът, в който се съдържат сперматозоидите, да е много малък (микрона), което прави броя на витрифицираните сперматозоиди много малък, като тази техника не е полезна за замразяване на спермата за изкуствено осеменяване или IVF, само за ICSI.

Вижда се обаче, че сперматозоидите могат да бъдат възстановени с техники за витрификация без добавяне на CPA, като се използват много високи скорости на охлаждане, които могат да зависят до известна степен от високата вродена пропускливост на мембраната за вода (Isachenko et al., 2004 ) или използване на захароза като единствен криопротектор (Hossain et al., 2007) или глицерол (Schuster et al., 2003). Следователно, ролята на техниките за витрификация на сперматозоидите все още не е изяснена.

Препратки

Merryman HT. Превишаването на минимално допустимия клетъчен обем в хипертонична суспензия като причина за замръзване. В: O'Connor GEW (изд.) Замръзналата клетка. Симпозиум на фондация CIBA. Churchill Press, Лондон 1970; 565-9.

Drobnis EZ, Crowe LM, Berger T, et al. Увреждането от студен удар се дължи на липидна фазова транзиция в клетъчните мембрани - демонстрация, използваща сперма като модел. J Exp Zool 1993; 265: 432–7.
Bailey JL, Robertson L, Buhr MM. Връзки между in vivo плодовитост, компютърно анализирана подвижност и in vitro Ca2 + поток в говежди сперматозоиди. Can J Anim Sci 1994; 74: 53–8.

Mazur P. Ролята на вътреклетъчното замразяване в смъртта на клетките, охладени с супраоптимална скорост. Криобиология 1977; 14: 251-72.

Fuller B, Paynter S. Основи на криобиологията в репродуктивната медицина. RBM на линия 2004; 9: 680-91.

Mazur P. Кинетика на загубата на вода от клетките при минусови температури и вероятността за вътреклетъчно замразяване. J Gen Physiol 1963; 47: 347-69.
Rall W, Reid D, Farrant J. Безобидно биологично замразяване по време на затопляне. Nature (Лондон) 1980; 286: 511-4.

Holt WV. Основни аспекти на замразеното съхранение на сперма. Anim Reprod Sci, 2000; 62: 3-22.

Nei T. Структура и функция на замразените клетки: модели на замръзване и оцеляване след размразяване. J Microsc 1978; 112 (2): 197-204.

Mazur P. Замразяване на живи клетки: механизми и последици. Am J Physiol 1984; 247, C125 - C142.

Leibo SP, Farrant J, Mazur P et al. Ефекти от замръзването върху суспензиите на стволови клетки от мозъка: взаимодействия на скоростите на охлаждане и затопляне в присъствието на PVP, захароза или глицерол.
Криобиология 1970; 6: 315–32.

Nei T. Механизъм на хемолиза на еритроцитите чрез замразяване, със специално позоваване на замразяване при температури, близки до нулата. В: Wolstenholme, G.E.W., O'Connor, M. Eds., Замръзналата клетка. Чърчил, Лондон, 1970; 131–47.

Mazur P, Leibo SP, Farrant J, et al. Взаимодействия на скоростта на охлаждане, скоростта на затопляне и защитната добавка върху оцеляването на замразени клетки от бозайници. В: Wolstenholme, G.E.W., O'Connor, M. Eds., The Frozen Cell, London: Churchill; 1970 69–88.

Lovelock JE. Хемолизата на човешките червени кръвни клетки чрез замразяване и размразяване. Biochim Biophys Acta 1953; 10 (3): 414-26.

Karow AM Jr., Webb WR. Замразяване на тъкани. Теория за нараняване и оцеляване. Криобиология 1965; 2 (3): 99-108.

Nijs M, Ombelet W. Криоконсервация на човешка сперма. Hum Fertil 2001; 4: 158-63.

Gao D, Liu J, Liu C, et al. Предотвратяване на осмотично увреждане на човешки сперматозоиди по време на добавяне и отстраняване на глицерол. Hum Reprod 1995; 10: 1109-22.

Gilmore JA, Liu J, Gao DY, et al. Определяне на оптимални криопротектори и процедури за тяхното добавяне и отстраняване от човешки сперматозоиди Hum Reprod 1997; 12: 112–8.

Lovelock JE, Polge C. Обездвижването на сперматозоидите чрез замразяване и размразяване и защитното действие на глицерола. Biochem J 1954; 58: 618–22.

Hammerstedt RH, Graham JK. Криоконсервация на птичи сперматозоиди: загадката на глицерола. Криобиология 1992; 29: 26–38.

Hammerstedt RH, Graham JK, Nolan JP. Криоконсервация на сперматозоиди от бозайници: какво ги молим да оцелеят. J Androl 1990; 11: 73–88.

Gilmore JA, McGann LE, Liu J, Gao et al. Ефект на разтворените вещества на криопротектори върху водопропускливостта на човешките сперматозоиди. Biol Reprod 1995; 53: 985–995.

Тейлър MJ, Song Y, Brockbank KG. Витрификация при запазване на тъканите: нови разработки. В: Fuller BJ, Lane N, Benson EE (eds) Life in the Frozen State. CRC Press, Boca Raton, Флорида, САЩ, 2004; 603–42.

Hossaim AM, Osuamkpe CO. Еднократна употреба на захароза при криоконсервация на човешки сперматозоиди. Arc Androl 2007; 53: 99-103.

Schuster TG, Keller LM, Dunn RL et al. Ултрабързо замразяване на много малък брой сперматозоиди с помощта на криолупи. Hum Reprod 2003; 18: 788-95.