Процедури за получаване на липиди-носители като системи за освобождаване на банкови хранителни съставки

  • Автори:Даниел Тенладо ван Дер Рейден
  • Директори на дисертации:Карлос Торес Оливарес (реж. Тес.), Гилермо Реглеро Рада (кодиращ. Тес.)
  • Четене: В автономния университет в Мадрид (Испания) през 2013г
  • Идиом: Испански
  • Дипломна квалификация:Tiziana Fornari (председател), Luis Vázquez de Frutos (тайна), Ana Ramírez de Molina (говорител), E. Ibáñez Ezequiel (говорител), Rosa María Blanco Martín (говорител)
  • Пълният текст не е наличен (Научете повече.)
  • Обобщение

    Синтезът на структуриран липид или липидният транспорт на вещество с биологичен интерес трябва да разчита на различни технологии, които трябва да се извършат. Тези технологии трябва да бъдат индустриално мащабируеми, евтини и чисти, както за околната среда, така и за получаване на краен продукт без примеси.

    като

    По време на процеса на синтез е необходимо по всяко време да се знае съставът на пробите, с които се работи, за които групата, в която е работил докторантът, е публикувала методи за анализ [1] и с които работят редовно.

    С цел да има нов инструмент за анализ и да направи количественото определяне на пробите по-стабилно, беше извършено разработването на нов метод за газова хроматография. Ставаше въпрос за разделяне на пробата в хроматографа по липидни класове и възможност за количественото им определяне, без да е необходимо да се извършва предварителна подготовка на пробата, за която беше направено директно инжектиране в колоната. За количествено определяне на инжектираните проби като вътрешни стандарти са използвани додекан и хексадекан. Получава се фактор на отговор за всеки от изследваните аналити посредством пет последователни инжекции от чисти стандарти при известни концентрации [2]. Във всички случаи разделителната способност на различните пикове е била по-голяма от 3,5, което показва пълно разделяне на всички изследвани компоненти.

    Ензимната биокатализа се доказа като ефективно, селективно и чисто средство както за синтеза, така и за катализа на липид. Използването на ензими в някакъв промишлен етап предполага висока цена на процеса, така че повторната употреба на биокатализатора е от съществено значение. От своя страна, повторната употреба на ензима трябва да се извърши по такъв начин, че полученият продукт да е винаги един и същ, независимо от цикъла на повторната употреба на същата партида биокатализатор. За това е необходимо да се моделира кинетиката на ензимната реакция, като се вземе предвид дезактивирането на ензима като един от ключовите параметри.

    След различни тестове, използващи различни ензими при множество условия на реакция, беше решено да се работи с липазата от Pseudomona cepacia (наскоро прекласифицирана като Burkhoderia cepacia) в реакции на алкохолиза, тъй като тя доведе до висока конверсия на триглицериди (90%) в намалени времена и повторната му употреба беше осъществима, тъй като дезактивирането му при реакции на алкохолиза беше много ниско. За да се работи с тази липаза, е разработен метод за имобилизиране, който позволява ензимът да бъде възстановен след всеки реакционен цикъл.

    Може да се види как концентрациите на FAEE, присъстващи в реакционната смес, варират по време на 2-ри, 5-ти, 10-и и 15-и цикъл. Концентрацията на FAEE при 6 часа реакция във 2-ри, 5-ти, 10-и и 15-и цикъл е съответно 1104,3, 897,7, 613,9 и 441,8 тМ. Тези резултати показват, че инактивацията на липаза има значителен ефект върху производството на FAEE. Ако деактивирането беше незначително, подобни нива на FAEE щяха да бъдат получени през четирите цикъла на изследване. За да се опише загубата на ензимна активност във времето, в кинетичния модел е включен термин за дезактивиране. За да се подобри качеството на напасването, се използва математически израз, за ​​да се опише ензимното дезактивиране, което разглежда необратим механизъм на дезактивиране, придружен паралелно от необратимо пренареждане на липаза, произвеждаща стабилна активна форма. Стойностите, получени с този модел на деактивиране на ензима, осигуряват добро съответствие на стойностите, получени с експерименталните данни.

    Този резултат показва, че най-вероятният механизъм за инактивация на липаза следва два паралелни процеса, водещи до стабилна и активна форма на липаза и неактивна форма. Поради това този модел на дезактивиране беше използван при прогнозиране на реакционните времена за оптимално повторно използване на биокатализатора. Включването на този термин за дезактивиране на ензима даде възможност да се използва концепцията за времето на псевдореакция, което трансформира реакционните времена на всеки цикъл в съответните им нови стойности, т.е. тези, които биха били получени, ако ензимът не беше частично деактивиран.

    Концепцията за времето на псевдореакция реагира на инактивирането на липазата и позволява коригиране на кинетичните данни на различните реакции, проведени с една и съща партида липаза, но с различна степен на дезактивиране. Важно приложение на тази концепция беше да може да се предскаже колко дълго реакционната смес трябва да остане в контакт с липазата, за да се постигне определена степен на алкохолиза, в зависимост от степента на дезактивиране на използваната липаза.

    Направена е първа прогноза със същата партида липаза, използвана в предишните 15 теста. Тази партида съответства на имобилизирана липаза, която работи в реакции на алкохолиза в продължение на 90 часа. Целта остава да се получи 90% конверсия на TAG, което води до концентрация на FAEE от 933,7 mM, която е определена като цел. Тази концентрация трябваше да бъде постигната, без да се отчита остатъчната активност на използваната липаза. Според предложения модел на дезактивиране, времето на псевдореакция, получено от тази концентрация на FAEE, е t * = 2,772 h. И накрая, използвайки уравнението, получено с кинетичния модел, беше възможно да се предвиди необходимото време, което 16-ият цикъл трябва да продължи, за да се получи моларната концентрация на FAEE, зададена като цел. Това време за реакция се оказа 19.7h. 16-ият цикъл на алкохолиза се провежда експериментално в продължение на 19,7 часа, като се получава FAEE концентрация от 876,0 mM. Този резултат разкрива разумно съвпадение между експерименталното преобразуване и това, предсказано от кинетичния модел.

    Като пример за липиден транспорт на вещество от биологичен и промишлен интерес беше проведено изследването на естерификацията на тирозола с олеинова мастна киселина. Това проучване се фокусира върху познаването на ефекта от различните променливи, които са се намесили в процеса. Реакцията се провежда при еквимоларни условия и в реакционна среда без разтворител. Изследвани са ефектите от размера на частиците тирозол, температурата, концентрацията на биокатализатора и намаленото налягане. В допълнение бяха проведени проучвания за повторно използване на биокатализатор, както и антиоксидантна активност чрез теста на ранцимат. Всички тези проучвания са проведени при сравняване на Candida antarctica липаза, имобилизирана в октил-силициеви агломерати, с Candida antarctica липаза, имобилизирана от Novozym (435).

    Трябва да се отбележи, че тирозолът не е разтворим в олеинова киселина при тестваните реакционни условия и че възможно ограничение на скоростта на реакцията е скоростта на разтваряне на тирозола в реакционната среда. По-рано е описано, че колкото по-малък е размерът на частиците на реагентите, толкова по-бърза е скоростта на реакцията [4]. Ограниченията на масовия трансфер, свързани със скоростта на разтваряне на тирозола в реакционната смес, бяха изследвани с използване на търговски тирозол и пресят тирозол с размер на частиците по-малък от 0,1 mm. По-висока реакционна скорост се постига чрез използване на тирозол с размер на частиците по-малък от 0,1 mm. Трябва да се отбележи, че в кратките времена на реакция (60 и 90 минути), използвайки пресят тирозол, скоростта на реакцията е приблизително 3 и 2 пъти по-бърза, отколкото при оригиналния тирозол. Подобно окончателно преобразуване обаче беше получено и в двата изследвани случая. В следващите експерименти като реакционен субстрат се използва пресят тирозол.

    Разтворимостта на тирозола в реакционната смес беше оценена, за което бяха проведени два различни теста. Първо, разтворимостта на тирозола в олеинова киселина беше сравнена при 40, 50 и 60 ° С. Разтворимостта на тирозола в тирозол олеат при 50 ° С също се определя. Получените резултати показват много ниска разтворимост на тирозол в олеинова киселина, но разтворимостта на тирозол в тирозол олеат е 4 пъти по-висока. Тези резултати показват, че тирозол олеатът, получен в реакцията на естерификация, подобрява разтворимостта на тирозола в реакционната смес, така че може да допринесе положително за скоростта на реакцията на естерификация.

    Ензимната естерификация на тирозола с олеинова киселина беше изследвана при три различни температури (40, 50 и 60 ° C) с двата ензима. Както се очаква, колкото по-висока е температурата, толкова по-висока е наблюдаваната степен на естерификация. Реакционното равновесие беше постигнато, когато тирозол олеатът достигна концентрации от 73% w/w при 40 ° C, 76% w/w при 50 ° C и 79% w/w при 60 ° C. Във всички изследвани случаи скоростта на естерификация е била по-бърза в присъствието на Novozym 435, отколкото в присъствието на октил-силициевите агломерати на липазата Candida antarctica. По-ниската активност на имобилизираната липаза в агломератите, в сравнение с търговската, вероятно се дължи на по-ниското натоварване на липаза Candida antarctica в агломератите. За да се запази максимално активността на липазата и да се сведе до минимум изпарението и разграждането на тирозола, експериментите бяха проведени оттук нататък при 50 ° C.

    Намаляването на процента на имобилизирана липаза, която се добавя към реакционната смес, има основното предимство да намали цената на биопроцеса, в допълнение към намаляването на количеството твърд материал в реакционната смес, факт, който е особено важен, когато процентът на материала твърдото вещество в реакционната смес е много високо, трябва да се отбележи, че в началото на реакцията тирозолът представлява приблизително 33% от реакционната смес. Два различни процента на имобилизирана липаза в ензимния синтез на тирозол олеат бяха сравнени, 5% и 10% тегл. Намаляването на количеството на биокатализатора води до значително намаляване на скоростта на реакцията с двете обездвижени липази, поради което в следващите експерименти е използван 10 тегловни% биокатализатор.

    Всички реакции на естерификация, проведени при атмосферно налягане, доведоха до продуктова смес, съставена от тирозолов олеат и различни количества нереагирала олеинова киселина и тирозол. За да се измести равновесието на реакцията към образуването на тирозолен олеат, трябва да се отстрани водата, получена по време на реакцията на естерификация.

    За да се постигне тази цел, могат да се използват различни стратегии, като азотно барботиране, използване на сушител или провеждане на реакцията при понижено налягане. Чрез реакцията под вакуум (200 mbar) се получава смес от продукти, съставена от повече от 85% тирозол олеат за по-малко от 3 часа, както с Novozym 435, така и с липазата на Candida antárctica, имобилизирана в октиловите агломерати. . Необходим е обаче по-голям вакуум, за да се отстрани напълно водата от реакционната смес. Следователно, за да се постигне конверсия на олеинова киселина и тирозол по-висока от 85%, се използва вакуум от 10 mbar.

    При тези условия се получава смес от продукти, съставена от повече от 95% тирозол олеат, за 2 часа за Novozym 435 и за 3 часа за липаза от Candida antarctica, имобилизирана в агломератите. Различното водно съдържание на двата имобилизирани ензима (1,77% за Novozym 435 и 2,17% за октил-силициевия агломерат) също може да играе важна роля в наблюдаваната скорост на реакцията.

    Друг важен аспект, който трябва да се вземе предвид, е частичната променливост на тирозола. Други автори [5] са забелязали, че прекомерният вакуум и температура могат да доведат до частична дестилация на тирозол. За да се оцени частичното изпаряване на тирозол, реакционна смес, подобна на описаната по-горе, но без добавяне на ензим, беше поставена под вакуум (10mb) за 8 часа. След това време се анализира аликвотна част от сместа и съдържанието на тирозол се сравнява със съдържанието на първоначалната смес. В анализираните проби се наблюдава идентичен процент тирозол, което показва, че при тестваните експериментални условия изпарението на тирозола е незначително.

    Отстраняването на водата от реакционната смес може да има два противоположни ефекта: 1) преместване на равновесието на реакцията към образуването на тирозолен олеат и 2) дехидратиране на имобилизираната липаза, което влияе върху остатъчната активност на биокатализаторите. Както бе споменато по-горе, повторната употреба на липаза е ключов фактор при прилаганата биокатализа. Следователно трябва да се постигне баланс между скоростта на реакцията и ензимната стабилност.

    За да се провери остатъчната активност на липазата след реакцията на естерификация, бяха проведени три последователни теста с една и съща партида и за двете липази.

    Опити 2 и 3 за ензимния синтез на тирозол олеат (и двата извършени с импрегнирана липаза, възстановена от реакционната смес от първото изпитване) развиха подобна скорост на реакция, което показва, че инактивирането на двата ензимни имобилизирани продукта може да се счита за незначително. Също така може да се забележи, че за двата обездвижени субекта, изследвани, опити 2 и 3 са по-бавни от първото проучване. Това може да се отдаде на увеличените дифузионни ограничения на реагентите, когато липазата е била предварително потопена в реакционната смес.

    При тези реакционни условия беше възможно да се получи смес от продукти, съставена от повече от 95% тирозолен олеат, за 2 часа с Novozym 435 и за 5 часа с октил-силициевите агломерати. Въпреки че стабилността на двата катализатора е сходна, скоростта на реакция, постигната с октил-силициеви агломерати, е по-ниска, отколкото с Novovozym 435. Оптимизиране на имобилизираните с помощта на октил-силициеви агломерати, за да се получи по-активен биокатализатор и/или с повече ензимно натоварване на грам подкрепа, е необходимо.

    За да се направи сравнение и на двата биокатализатора за естерифициране на тирозол с олеинова киселина, това беше извършено с използване на същите единици за активност (1,687 AU) на Novozym 435 и на имобилизираната липаза Candida antarctica в октилни агломерати. -Силика. Резултатите показват, че скоростта на реакцията е сходна с двете изследвани липази. Поради това той стигна до заключението, че разликата в скоростта на реакцията не се дължи на увеличаване на масовия трансфер или ограниченията на дифузията поради октил-силициевите агломерати и следователно може да се твърди, че разликите в скоростта на реакциите, наблюдавани в предишните експерименти се дължат изключително на по-голям брой милиграми ензим на грам носител в Novozym 435, в сравнение с тези на липаза Candida antarctica, имобилизирана в октил-силициеви агломерати. Поради тази причина е удобно да се извършват нови проучвания, за да се подобрят товароносимостта на новия носител, като по този начин може да се включи по-голямо количество ензим на грам биокатализатор.

    В допълнение, различната процедура за производство на тирозолни естери може да доведе до различни крайни антиоксидантни активности на получените съединения.

    Реакцията, наблюдавана в предишните експерименти, се дължи изключително на по-голям брой милиграми ензим на грам носител в Novozym 435, в сравнение с тези на Candida antarctica липаза, имобилизирана в октил-силициеви агломерати. Поради тази причина е удобно да се извършват нови проучвания, за да се подобрят товароносимостта на новия носител, като по този начин може да се включи по-голямо количество ензим на грам биокатализатор.

    В допълнение, различната процедура за производство на тирозолни естери може да доведе до различни крайни антиоксидантни активности на получените съединения.