Обобщение
Тук описваме прост, евтин и бърз метод за почистване за разрешаване на 3D структурата на бялата мастна тъкан на човек и мишка, като използваме комбинация от маркери, за да визуализираме васкулатурата, ядрата, имунните клетки, невроните и липидните капкови протеини, използвайки флуоресцентни изображения.
Резюме
Въведение
Затлъстяването се характеризира с увеличаване на масата на мастната тъкан и се е превърнало в основен проблем на общественото здраве по целия свят, тъй като хората със затлъстяване са изложени на повишен риск от развитие на сърдечно-съдови заболявания, диабет тип 2, чернодробни заболявания и някои видове рак.
Основна физиологична функция на мастната тъкан е да модулира холеостазата на глюкозата и липидите в цялото тяло 1, 2. По време на периода на хранене адипоцитите (т.е. основните клетки на мастната тъкан) съхраняват излишната глюкоза и липиди, осигурени от хранене, в триглицериди. По време на гладуване адипоцитите разграждат триглицеридите до нестерифицирани мастни киселини и глицерол, за да поддържат нуждите на тялото от енергия. По време на развитието на затлъстяването мастната тъкан се разширява, увеличавайки размера (хипертрофия) и/или броя (хиперплазия) на адипоцитите 1, за да увеличи капацитета му за съхранение. Когато разширяването на мастната тъкан достигне своята граница, силно променлива константа сред пациентите, останалите липиди се натрупват в други метаболитни органи, включително мускулите и черния дроб 3, 4, което води до тяхната функционална недостатъчност и инициира свързани сърдечно-метаболитни усложнения със затлъстяване 15. Следователно идентифицирането на механизмите, които управляват разширяването на мастната тъкан, е ключово клинично предизвикателство.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Този протокол беше тестван и валидиран за всички депозити на мишки и човешка бяла мастна тъкан. Мастните тъкани на хора и мишки бяха събрани в съответствие с европейските закони и одобрени от френския и шведския етичен комитет.
1. Фиксиране на бяла мастна тъкан на мишка и човек
2. Пермеабилизация и насищане на бяла мастна тъкан на мишка и човек
3. Процедура за оцветяване на бяла мастна тъкан на мишка и човек
4. Процедура за почистване на бяла мастна тъкан на мишка и човек
5.3D-конфокално изобразяване на прозрачна бяла мастна тъкан
- Прехвърлете тъканта в метална камера за изображения, снабдена със стъклено дъно (вж Таблица на материалите)под химически абсорбатор и напълнете камерата с пресен метил салицилат.
ЗАБЕЛЕЖКА: За да закрепите тъканта на място и по този начин да я предотвратите да се носи или да се движи настрани в камерата, нанесете множество 18 мм кръгли стъклени капаци (вижте Таблица на материалите)върху плат, когато се монтира на камерата. - Поставете камерата за изображения върху обърнат конфокален микроскоп.
- Изобразяване на тъканта с помощта на обектив с ниско увеличение (например 4х обектив), за да се генерират няколко cm 3 3D карти на цялата мастна тъкан или пробата от човешка тъкан.
- Изберете няколко области за вземане на проби от тъкани при по-голямо увеличение. Обикновено използвайте 20x въздушен обектив с голям обсег, който осигурява добро съотношение между резолюция и дълбочина. Придобиваме големи мозаечни изображения с z-стекове с дълбочина между 600 и 2000 m.
ЗАБЕЛЕЖКА: Използвайте обектив на дълги разстояния, за да пробиете тъканта.
6. Извличане на количествени резултати от 3D изображения на мастна тъкан
ЗАБЕЛЕЖКА: Сегментирането на различните структури и последващото извличане на количествената информация от стека на 3D изображения, генерирани в точка 5, може да се извърши с помощта на която и да е от многото съществуващи опции за софтуер за анализ на изображения, било то търговски или безплатни. В следващите точки ние описваме стратегия, която често се използва в нашата лаборатория за извличане на количествена информация от 3D изображения на мастна тъкан с помощта на търговски софтуер (вж. Таблица с материали).
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
Използвайки процедурата, описана тук и обобщена на Фигура 1,успяхме да оцветим и почистим бялата мастна тъкан на човек и мишка, както е показано на фигура 2А и Фигура 2В,съответно. Прозрачната тъкан беше прехвърлена в металната камера за изображения за конфокално изобразяване (Фигура 3А). Клирънсът драстично подобри дълбочината на тъканните изображения, които успяхме да получим (Фигура 3В и фигура 3С). Цялата мастна тъкан може да бъде получена в 3D при ниско увеличение с помощта на 4х обектив (вж Допълнителен филм 1),за генериране на 3D карта, позволяваща да се избират различните области, които да се придобият с голямо увеличение, като се използва 20x обектив (Фигура 3D). Изображенията с голямо увеличение се получават в 3D с дълбочина 2 mm (Фигура 3E).
Фигура 1: Обобщение на процедурата за изчистване на бяла мастна тъкан. Белите или мишите мастни тъкани са фиксирани, проникнати, наситени, оцветени и прозрачни. Изображенията се получават в 3D и се анализират с помощта на търговски софтуер. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.
Фигура 2: Снимки на бяла мастна тъкан. (ДА СЕ) Снимка на човешка бяла коремна мастна тъкан преди и след процедурата за избелване. (Б.) Снимка на епидидична бяла мастна тъкан на мишка преди и след процедурата за изчистване. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.
Фигура 5: Анализ на 3D изображения с помощта на наличен в търговската мрежа софтуер (виж таблицата с материали). (ДА СЕ) 3D обемно представяне на сегментирани човешки адипоцити в 3D чрез наличен в търговската мрежа софтуер. Всеки адипоцит има различен цвят от съседните му адипоцити в контакт. Контейнерите са представени в червено. (Б.) Количествено определяне и разпределение на размера на адипоцитите от 3D обемното представяне на панел А, който съдържа около 20 000 адипоцити. (° С) 3D обемно представяне на кръвоносни съдове, сегментирани в 3D с помощта на наличния в търговската мрежа софтуер и представени съответно в червено или жълто за големи и малки съдове. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.
Допълнителен филм 1: 3D визуализация на обем на цялата подкожна бяла мастна тъкан, показана на фигура 3D. Бялото поле представлява куб 2 см 3. Моля, кликнете тук, за да изтеглите това видео.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Дискусия
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Разкриване
Авторите нямат конфликти за разкриване.