Текстът завършен

(1) ФАКУЛТЕТ ПО БИОХИМИЧНИ И ФАРМАЦЕВТИЧНИ НАУКИ UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO. Институт по молекулярна и клетъчна биология на Росарио. Докторска дисертация по биологични науки. Селективно разпознаване на сензор/оператор в моновалентни регулатори на реакция на метал в Salmonella enterica. Представено от: лиценз Мария Виктория Хумберт Режисьор: д-р Фернандо С. Сончини. Росарио, Аржентина 2014.

отговор

(2) 1. Селективно разпознаване на сензор/оператор в моновалентни регулатори на реакция на метал в Salmonella enterica. Мария Виктория Хумбърт Завършила биотехнологичен факултет по биохимични и фармацевтични науки Национален университет в Росарио. Тази дипломна работа е представена като част от изискванията за придобиване на академична степен на доктор на биологичните науки от Националния университет в Росарио и не е представяна преди това за получаване на друга степен в този или друг университет. Той съдържа резултатите, получени в изследвания, проведени в Института по молекулярна и клетъчна биология на Росарио (IBR-CONICET), област Молекулярна биология на патогенни микроорганизми, в зависимост от Факултета по биохимични и фармацевтични науки, в периода между 04 юни 2009 г. и 27 март 2014 г. под ръководството на д-р Фернандо С. Сончини.

(3) 2. На моето семейство и приятели.

(6) Индекс. ИНДЕКС СЪКРАЩЕНИЯ. 10. ВЪВЕДЕНИЕ. 13. 1. Родът Salmonella 1.1. Инфекциозен цикъл на салмонела и оцеляване в околната среда. 14 15. 2. Родът Escherichia. 16. 3. Salmonella enterica и Escherichia coli като модели за изследване. 17. 4. Транскрипционни регулатори. 18. 4.1. Семейство MerR на транскрипционни регулатори. 18. 4.2. Структура на регулаторите от семейство MerR. 19. 4.2.1 HTH домейн: общ знаменател в транскрипционните регулатори 4.3. MerR регулатори и тяхното взаимодействие с ДНК. 20 23. 4.3.1 Типични регулатори на MerR: класическа парадигма на регулиране на транскрипцията 4.3.2 Неконвенционални регулатори на MerR. 23 26. 4.3.2.1 CarA/CarS регулатори. 28. 4.3.2.2 Регулатори на LitR. 31. 4.3.2.3 Регулатори MlrA. 32. 4.3.2.4 BluR регулатори. 37. 4.3.2.5 Hsp_2 регулатори. 37. 5. Метали: основни, несъществени и токсични. 38. 5.1. Класификация на металите. 38. 5.2. Стратегии на хомеостазата/устойчивост на преходни метали. 39. 6. Медна хомеостаза 6.1. 6.2. Медна хомеостаза при Е. coli. 40 41. 6.1.1 Регулаторът. 42. 6.1.2 Регулонът. 43. 6.1.3 Алтернативната система за устойчивост на мед PcoABCD. 44. Медна хомеостаза при салмонела 6.2.1 Регулонът на репликата. 45 45. 5.

(10) Индекс. 2.1. Високите нива на STM1266 намаляват подвижността. 149. 2.2. Свръхекспресията на STM1266 стимулира образуването на биофилми. 150. 2.3. Индукцията на STM1266 увеличава производството и секрецията. 2.4. на целулоза. 152. Високите нива на STM1266 придават устойчивост на стрептомицин. 153. 3. STM1266 и неговото значение в регулирането на образуването на биофилми. 155. Дискусия. 158. 1. Сравнителен анализ на транскрипционната регулация на csgD при Е. coli и S. enterica. 159. 2. Протеини с GGDEF домейни: положителна регулация на csgD. 164. 3. Протеини с EAL домейни: отрицателна регулация на csgD. 166. ОБЩИ ЗАКЛЮЧЕНИЯ. 168. РЕЗЮМЕ. 174. БИБЛИОГРАФСКА ЛИТЕРАТУРА. 176. 9.

(11) Съкращения. Съкращения А. Усилватели. Коремни мускули. Абсорбция ДНК. Дезоксирибонуклеинова киселина. AHL. N-ацил-хомосерин лактон. Усилвател Ампицилин. РНК. Рибонуклеинова киселина. ARNPol. РНК полимераза. ATP. Аденозин 5´ трифосфат. BCIP. 5-бромо, 4-хлоро, 3-индофосфат. BSA. Говежди серумен албумин. Cbl. Кобаламин. c-di-GMP. бис- (3 '; 5') -гуанозин цикличен монофосфат. Вж. Крайна концентрация. Ci. Кюри. CIM. Минимална инхибиторна концентрация. См. Левомицетин. С-терминал. Карбоксил-терминал. DGC. Дигуанилат циклаза. DNase I. Дезоксирибонуклеаза I. DTT. Дитиотреитол. ЕО. Ешерихия коли. EGTA. Етилен гликол бис (β-аминоетил етер) N, N, N ', N'-тетраоцетна киселина. EMSA. Тест за забавяне на електрофоретичната подвижност. Стрептокок. Стрептомицин. Fw. Директен. 10.

(12) Съкращения g. Грам. g/l. Грами на литър. HPLC. Течна хроматография под високо налягане. HTH. Helix-turn-helix. IPTG. Изопропил β-D-тиогалактопиранозид. kA. Константа на равновесие (асоциация). kb. Килобаза. kD. Константа на равновесие (дисоциация). Км. Канамицин. LB. Лурия Бертани. NB. Хранителен бульон. NBT. Нитротетразолиум синьо. nt. Нуклеотид N-терминал. Амино-терминал. ONPG. O-нитрофенил-галактопиранозид. ORF. Отворена рамка за четене. стр. Плазмид. П. Промоутър. pb. Основни двойки. PCR. Полимеразна верижна реакция. PDE. Фосфодиестераза. (p) ppGpp. Гуанозин пентафосфат. п/v. Тегло в обем. r. Флуоресцентна анизотропия. А. Устойчив. ЯМР. Ядрено-магнитен резонанс. об/мин. Обороти в минута. единадесет.

(13) Съкращения Rv. Обратно. SDS. Натриев додецил сулфат. SN. Супернатант STM. Salmonella Typhimurium. Tc. Тетрациклин. U. Unit. или. а . Произволни единици. U. M . Miller Units. UFC. Единици, образуващи колонии. UV. Ултравиолетово. V. Волтове. Vf. Краен обем. v/v. Обем по обем. КАКВО. Спирала-крило-спирала. X-gal. 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-галактопиранозид. α. Helix-α. β. Лист-β. Δ. Изтриване 12.

(25) Въведение. (Железнова Хелдвайн и Бренан, 2001). Взаимодействието на регулатора с неговия коактиватор не влияе значително върху неговия афинитет към ДНК. Вместо това причинява конформационна промяна, която се предава интрамолекулярно на ДНК свързващия домейн и в крайна сметка води до отпускане на кривината и размотаване на ДНК в операторската последователност, което води до пренареждане на кутиите -35 и -10, формиране на комплекса, отворен от RNAPol, и последващото иницииране на транскрипция (Фиг. 5) (Ansari et al., 1992, Outten et al., 1999; Zheleznova Heldwein and Brennan, 2001; Newberry and Brennan, 2004). размотаването на ДНК води началото си от отслабването на водородните връзки на основната двойка AT, което обикновено се намира в центъра на симетричната диада на оператора, което позволява изкривяване в центъра на него. Това изместване на основата ще бъде стабилизирано от взаимодействието между протеиновите остатъци и фосфатния скелет на ДНК. Тъй като идентичността на централната основна двойка на палиндромната последователност се запазва като аденин или тимин в повечето MerR промотори и се добавя към факта, че те не влияят на афинитета на регулатора. 24.

(27) Въведение. 4.3.2 Неконвенционални регулатори на MerR Последните проучвания при по-различни членове на това семейство, като CarA, LitR, MlrA, BluR и HspR_2, показват механизми на взаимодействие с ДНК, които са различни от единния модел на действие, споменат в предишния раздел . В тази новоохарактеризирана подгрупа регулатори регулаторът може да действа или като активатор, или като репресор на техните целеви гени. Моделът на действие би включвал и участието на други регулаторни протеини, които ще се конкурират за взаимодействието на регулатора от типа MerR с ДНК или биха предотвратили взаимодействието му с операторската последователност, като се присъединят директно към ДНК-свързващия домен чрез протеиново взаимодействие. -протеин и по този начин измества регулатора на MerR от целевото му място. Освен това, сравнителен анализ на целевите операторски последователности, разпознати от нетипични регулатори на MerR (Фиг. 7-Б), разкрива значителни разлики с тези, признати като характерни оператори на това семейство, като обезсилва възможността за установяване на общи правила, които описват общ структурен и функционален механизъм сред всички MerR транскрипционни регулатори.

(28) Въведение. В конкретния случай на операторите, разпознати от неконвенционалните регулатори на MerR, симетричната диада е разположена отклонено от кутиите -35 и -10, обикновено насложени върху кутията -35 или нагоре от нея (Фиг. 7-B). Тази структурна характеристика, необичайна за повечето оператори на MerR (фиг. 7-А), показва, че моделът на механистично регулиране, обикновено репресия, ще бъде различен от предложения за конвенционални или типични регулатори от типа MerR. При неконвенционалните регулатори това не би зависело от конформационната реконфигурация на оператора и преместването на кутиите -35 и -10, опосредствани от регулатора, което предполага два различни модела на регулиране в това семейство регулатори. 27.

(29) Въведение. Филогенетично свързани и структурно аналогични, особено на нивото на N-крайния ДНК-свързващ домейн (фиг. 8) 4.3.2.1 CarA/CarS регулатори В групата на нетипичните MerR транскрипционни регулатори се различават регулаторите от типа CarA/LitR, които присъстват в техния С-краен домен мотив, свързващ се с кобаламин (витамин В12). Те участват в модулирана от светлината транскрипционна регулация в голямо разнообразие от не-фототрофни бактерии (актинобактерии и грам-отрицателни бактерии като Pseudomonas, Shewanella и Vibrio). Инхибирането на фотооксидативния стрес чрез производството на каротеноиди, жълти, оранжеви или червени пигменти, които предпазват клетката от увреждане, причинено от свободните радикали на кислорода, е силно характеризирана фотозависима физиологична характеристика при много нефототрофни бактерии. Важна група бактериални видове натрупват този клас пигменти, когато са осветени. Това предполага еволюционно запазване на определена регулаторна система, която преобразува светлинен сигнал в експресията на гени, необходими за биосинтеза на каротеноиди. Подробностите за тези регулаторни системи все още са неизвестни.

(35) Въведение. Косвен биосинтез на целулоза чрез транскрипционно активиране на AdrA. Този протеин има дигуанилат циклазна активност, поради което е способен да стимулира производството на цикличен бис- (3 ', 5') -гуанозин монофосфат (c-di-GMP), повсеместна бактериална сигнална молекула. Тогава този метаболит действа като решаващ вторичен пратеник за биосинтеза на целулоза и, вероятно, други екзополизахариди (фиг. 12-А). Регулирането на CsgD се счита за ключово при вземането на решения между планктонната форма на живот и формирането на биофилми . MlrA не е единственият фактор, участващ в транскрипционната регулация на csgD, но има и други регулатори, които модулират експресията на csgD в много различни индуциращи условия: по време на стационарната фаза на растеж поради липсата на хранителни вещества, при микроаеробиоза, при аеробиоза при минимална среда, при алкално рН (рН 8,5), нисък осмоларитет и при температура (28 ºC). Ето защо промоторът на csgD е признат за един от най-сложните промотори на Е. coli (Gerstel et al., 2003; Ogasawara et al., 2010; Ogasawara et al., 2011). MlrA свързващата последователност в csgD промоторния регион (Фиг. 7-B) се състои от 11 bp обърнато повторение с 12 bp интервал (MlrA-кутия) и е така. 3. 4.