Субекти

Обобщение

Въведение

Подобно на клетки от бозайници, арестувани на мястото на рестрикция на G2, ооцитите на Xenopus (етап VI) естествено спират на границата G2/M на първото мейотично делене и възобновяването на мейотичните клетъчни цикли изисква стимулация и активиране на митогена на каскадата MAPK. При физиологични условия прогестероновата стимулация на напълно израсналите ксенопусни ооцити освобождава ареста на G2 фаза чрез активиране на митотичен Cdk 25, а процесът включва активиране на MAPK каскадата от новосинтезираната MOS протеинкиназа, която от своя страна активира MEK. 26, 27, 28, 29 Поради сходството в свързването на MAPK каскадата с регулирането на G2/M прехода, очертайте молекулярния механизъм, чрез който MAPK каскадата насърчава G2/M прехода в стимулирани осецити на Xenopus с прогестерон. Нови механични прозрения за това как тази каскада регулира положително G2/M прехода в соматични клетъчни цикли.

В това проучване ние характеризираме ролята на RSK във фосфорилирането и активирането на човешки изоформи на Cdc25 (hCdc25) в човешките клетъчни линии. Нашите резултати предоставят доказателство, че RSK играе важна роля във фосфорилирането и активирането на hCdc25A и hCdc25B в процеса на преход G2/M.

Резултати

Рекомбинантни RSK фосфорилират hCdc25 изоформи A, B и C в консервиран мотив близо до каталитичния домен

Сред многобройните потенциални места за фосфорилиране на RSK при xCdc25C, RSK2 предимно фосфорилира S317, T318 и/или S319 при мотива 313 KRRRSTS 319. 36 Сдвоеното подравняване на hCdc25A, hCdc25B и hCdc25C с xCdc25C показа, че местата за фосфорилиране на RSK2 на xCdc25C се намират в запазена област близо до каталитичния домейн (Фигура 1а). В този запазен регион трите hCdc25 изоформи съдържат верига от основни остатъци, които се подравняват с веригата от основни остатъци в xCdc25C. Следвайки основната верига от остатъци, има два остатъка Ser в hCdc25A (S293 и S295), остатък Ser и остатък Thr в hCdc25B (S353 и T355) и остатък Ser в hCdc25C (S247). Тези остатъци Ser/Thr се подравняват с местата за фосфорилиране на RSK2, идентифицирани в xCdc25C (Фигура 1b). Запазването на последователността предполага, че RSK фосфорилира множество изоформи на hCdc25 в този запазен мотив.

cdc25a

Изображение в пълен размер

За да тестваме тази възможност, първо инкубирахме сравними количества GC-маркирани hCdc25A, hCdc25B или hCdc25C (1–2 µg) с конститутивно активен миши RSK (CA-RSK) за 30 минути в присъствието на γ- 32 P-ATP . GST-xCdc25C се използва като положителна контрола. Както е показано на фигура 1в, CA-RSK катализира подобни или по-високи нива на 32 P-включване в GST-hCdc25A, GST-hCdc25B и GST-hCdc25C в сравнение с положителната контрола. След това мутирахме Ser293 и Ser295 в hCdc25A към Ala293/Ala295 (2A), Ser353 и Thr355 в hCdc25B към Ala353/Val355 (AV) и Ser247 в hCdc25C към Ala247 (1A) и определихме ефекта върху CA-RSK-катализатора - фосфизиран. Както е показано на Фигура 1г, тези мутации значително намаляват CA-RSK-медиираното фосфорилиране на hCdc25 изоформите. Заедно тези резултати показват, че пречистеният RSK е способен да фосфорилира запазения мотив и в трите изоформи на hCdc25.

Рекомбинантен RSK и ендогенен RSK в Xenopus яйце екстракти фосфорилират всички предвидени RSK места в hCdc25 изоформи

CA-RSK фосфорилира всички предполагаеми RSK места в hCdc25 изоформи. Обездвижените GST-hCdc25 протеини се подлагат на макет или се фосфорилират с CA-RSK. Протеините, елуирани от измитите мъниста, се имуноблотират с всяко от посочените фосфоспецифични антитела след оцветяване с Ponceau S (Ponc). Контекстът на последователността на фосфорилиращото място, разпознат от всяко от фосфоспецифичните антитела, е посочен по-долу чрез имуноблотинг. ( да се - ° С ) Фосфорилиране на дивия тип (WT) и S293A-S295A (2A) мутантна форма на GST-Cdc25A. ( д Y. и ) Фосфорилиране на мутантната (AV) WT и S353A-T355V форма на GST-Cdc25B. ( F ) Фосфорилиране на WT и S247A (1A) мутантна форма на GST-Cdc25C.

Изображение в пълен размер

RSK сайтовете в hCdc25A и hCdc25B са за предпочитане фосфорилирани в митотични клетки

За да се характеризира RSK-медиирано фосфорилиране на Cdc25 в клетки на бозайници, първо беше определено дали фосфорилирането на RSK места в hCdc25 изоформи е свързано с М-фаза. Човешки ембрионални бъбречни клетки HEK293 (трансформирани) и PC-3mm2 човешки клетки на рак на простатата ( метастатичен) нараства асинхронно (~ 5% клетки при митоза) или се синхронизира при митоза чрез тимидинова блокада, последвана от блок нокодазол (> 80% клетки при митоза). След като денатурираните екстракти на произволни (R) и митохондлично синхронизирани (M) клетки бяха биохимично проверени чрез имуноблотинг с митотичното фосфопротеиново моноклонално антитяло MPM-2 (Фигури 3а и b), фосфорилирането на hCdc25 на местата на RSK с имуноблот. фосфоспецифични антитела. Трябва да имаме предвид, че клетките HEK293 експресират и трите изоформи на hCdc25, докато клетките PC-3mm2 изразяват само откриваеми нива на hCdc25A и hCdc25B (данните не са показани).

RSK местата в hCdc25A и hCdc25B са за предпочитане фосфорилирани в митотични клетки. Протеинови екстракти от HEK293 R и М клетки или PC-3mm2 клетки бяха имуноблотирани с MPM-2 или антиактиново антитяло ( a и b ), с анти-hCdc25A антитяло или A-pS293 антитяло ( c и d ), или с анти-hCdc25B антитяло или B-pS353 антитяло ( и Y. F ). Стрелките показват протеини с пълна дължина, а звездичките показват изместен hCdc25A.

Изображение в пълен размер

За hCdc25A фосфорилирането на S293 беше лесно откриваемо само в екстракти от М клетки (Фигури 3в и d). За разлика от това, нивото на hCdc25A протеин е сходно между R и M екстрактите на PC-3mm2 клетки. Въпреки че нивото на hCdc25A протеин е 2 до 3 пъти по-високо в М, отколкото в R екстрактите от клетки HEK293, тази разлика не може да обясни приблизително 10-кратна разлика в нивото на S293 фосфорилиран hCdc25A. За hCdc25B фосфорилирането на S353 също беше лесно откриваемо само в екстракти от клетъчни клетки М. В този случай нивото на hCdc25B протеин беше сходно между R и M клетъчните екстракти за двете клетъчни линии (Фигури 3д и f). За hCdc25C, S247 фосфорилиране беше открито на гранични нива както в R, така и в M екстракти на клетки HEK293, въпреки наличието на лесно откриваеми нива на hCdc25C протеин (данните не са показани). Тези резултати показват, че RSK местата на hCdc25A и hCdc25B, но не и hCdc25C, са за предпочитане фосфорилирани в митотични клетки.

За по-нататъшно проучване на тази възможност ние инкубирахме GST-hCdc25A, GST-hCdc25B или GST-hCdc25C с различни разреждания на неденатурирани митотични екстракти (EM) за 30 минути и определихме фосфорилирането на мястото на RSK чрез имуноблотиране с фосфоспецифични антитела (Допълнителна фигура S2). Както за клетки HEK293, така и за PC-3mm2, дори GST-hCdc25A и GST-hCdc25B лесно се разреждат 1: 64 ME в местата на RSK. За разлика от това, само неразредена ЕМ от клетки HEK293 фосфорилира при S247 в GST-hCdc25C и не се открива фосфорилиране на GST-hCdc25C в S247 с неразредена ЕМ от клетки PC-3mm2. Тези резултати подкрепят преференциалното фосфорилиране на RSK места в hCdc25A и hCdc25B в митотични клетки.

Фосфорилирането на RSK места върху hCdc25A и hCdc25B увеличава техните M-фазови индуциращи дейности

За да определим функционалното въздействие на RSK-медиираното фосфорилиране на hCdc25A и hCdc25B, ние инжектирахме дивите и RSK мутантни форми на myc-маркирани hCdc25A или hCdc25B и сравнихме техните способности да индуцират зреенето на ооцитите на Xenopus. 32, 41, 42 За myc-hCdc25A, фосфодефективният мутант индуцира mat50% зреене на ооцитите със закъснение от 1 h в сравнение с дивия тип молекула (допълнителна фигура S3A). За разлика от това, фосфомиметичният мутант индуцира узряването на ооцитите със скорости, подобни на тези на молекулата от див тип (допълнителна фигура S3B). За myc-hCdc25B, див тип протеин индуцира mat50% зреене на ооцитите на 4 часа, докато фосфодефективният мутант индуцира 50% съзряване на ооцитите на 8 часа (допълнителна фигура S3C). Отново фосфомиметичният мутант действа подобно на дивия тип протеин (допълнителна фигура S3D). Тези резултати показват, че фосфорилирането на RSK местата в hCdc25A и hCdc25B увеличава техните индуциращи дейности на М фазата.

Изображение в пълен размер

RSK е една от основните кинази в митотичните клетъчни лизати, които фосфорилират RSK местата на hCdc25A и hCdc25B

По-рано беше показано, че Aurora киназа А фосфорилира hCdc25B S353 в центрозоми в началото на митозата. 44,45 Други AGC протеинкинази от фамилия в митотични клетки могат също да фосфорилират RSK места в hCdc25 изоформи поради сходните им места за приемане на фосфорилиране. 46, 47 За да характеризираме приноса на RSK за митотичното фосфорилиране на hCdc25A и hCdc25B в местата на RSK, ние фосфорилирахме GST-hCdc25A и GST-hCdc25B с M (ME) екстракти от клетки HEK293 или PC-3mm2 в присъствието или липсата на RSK2 инхибиторът BI-D1870 или SL0101 и имуноблотираните субстрати с фосфо-специфични антитела; Фосфорилирането на същите субстрати с Xenopus MEE служи като положителен контрол.

В 1: 30-разреден ME от клетки HEK293, 2 μM BI-D1870 или 40 μM SL0101 причиняват 50% намаляване на фосфорилирането на GST-hCdc25A при S293 (Фигури 5а и b) и на GST-hCdc25B при S353 (Фигури 5в и г). Подобни резултати бяха получени, когато се извършва фосфорилиране с ME, разредено 1: 60 от PC-3mm2 клетки или XEEPUS MEE, разредено 1: 20 (данните не са показани). Въпреки това не се наблюдава инхибиране, когато се извършва фосфорилиране с неразреден ME или MEE (данните не са показани). Тези резултати показват, че RSK е една от основните кинази в митотични и мейотични клетъчни лизати, които фосфорилират RSK местата в hCdc25A и hCdc25B.

RSK инхибиторите частично инхибират фосфорилирането на RSK места върху hCdc25A и hCdc25B в митотични клетъчни лизати. Имобилизираният GST-hCdc25A ( a и b ) и GST-hCdc25B ( c и d ) са фосфорилирани с 1: 30 разреден ME от клетки HEK293 в присъствието или отсъствието на посочените концентрации на BI-D1870 (а и в) или SL0101 ( byd ) при стайна температура за 30 минути. Протеините, елуирани от измитите зърна, бяха имуноблотирани с посочените фосфоспецифични антитела.

Изображение в пълен размер

RSK-медиираното фосфорилиране на hCdc25 има положителна роля в прехода G2/M

Инхибирането на активността на RSK от RSK инхибитори инхибира прехода G2/M. ( a и b ) HEK293 клетки, освободени от единичен тимидинов блок, са култивирани в присъствието само на ноходазол (NC) или NC плюс BI-D1870 ( да се ) или SL0101 ( б ) за посочените часове и извлечените протеини бяха имуноблотирани. MPM-2 след оцветяване с Ponceau S (Ponc) (горни панели) или имуноблотинг с анти-hCdc25A и A-pS293 антитела (долни панели). Стрелките показват позицията на hCdc25A, а звездичките показват кръстосано реактивни полипептиди. ( c и d ) PC-3mm2 клетки, освободени от единичен тимидинов блок, бяха третирани, както е описано на фигури 6а и b.

Изображение в пълен размер

Известно е, че RSK има различни биологични функции. За да определим дали насърчаването на активирането на Cdc25 е поне един от основните механизми, чрез които RSK насърчава прехода G2/M, екктотично изразихме дефектните или миметични диви или RSK мутантни форми на FLAG-hCdc25B в задържани клетки HEK293T. S фаза и сравниха техните способности да противодействат на инхибиторния ефект на BI-D1870 върху последващия преход G2/M. Тъй като нефосфорилираният Cdc25B има основно ниво на фосфатазна активност, се очакваше, че и трите форми на FLAG-hCdc25B имат някои спасителни ефекти. Ако обаче насърчаването на Cdc25 активиране е важен механизъм, чрез който RSK насърчава прехода G2/M, фосфомиметичната форма на FLAG-hCdc25B трябва да бъде по-мощна от другите две форми на молекулата, за да спаси инхибиторния ефект на BI-D1870.

Наблюдавахме митотично навлизане в h 7 h след освобождаване на арест на S фаза в контролни клетки. Както е показано на Фигура 7а, ~ 50% от нетрансфектираните клетки са влезли в митоза без лечение с BI-D1870, докато

Фосфомиметичната мутантна форма на hCdc25B по-ефективно спасява инхибиторния ефект на BI-D1870 при прехода G2/M. ( да се ) Експоненциално нарастващите HEK293T клетки бяха третирани с тимидин за около 12 часа и след това трансфектирани с експресионния вектор за дивия тип (WT) или RSK фосфодефективното (AV) място или фосфомиметичната (2D) мутантна форма на FLAG-hCdc25B или празна родителски вектор (V). След като трансфектираните клетки бяха допълнително култивирани в продължение на приблизително 6 часа в продължаващото присъствие на тимидин, всички клетки бяха превключени в хранителна среда, допълнена с нокодазол (NC) плюс BI-D1870 или DMSO (диметилсулфоксид). Приблизително 7 часа след промяната на средата, три полета от произволно избрани клетки бяха заснети под фазов контрастен микроскоп и процентите на клетките, показващи кръгла митотична морфология, бяха определени ръчно от заснетите изображения. Грешките показват sd ( б ) Имуноблоти на клетъчни лизати с анти-FLAG и анти-актинови антитела. ( ° С ) Представителни фазово-контрастни микроскопични изображения. Стрелките показват клетки с кръгла митотична морфология.

Изображение в пълен размер

Един от ключовите места за активиране в RSK е за предпочитане фосфорилиран в митотични клетки.

Едно от местата за активиране в RSK е за предпочитане фосфорилирано в митотични клетки. ( да се - ° С ) Денатурираните R и M екстракти от клетки HEK293 бяха имуноблотирани с MPM-2 след оцветяване на Ponceau S (Ponc) ( да се ), или имуноблотирани с анти-RSK1 и анти-RSK2 антитела, или анти-фосфо-S227 и анти-Фосфо-Т359 - S363 антитела ( б ). М екстрактите бяха имунопреципитирани с анти-RSK1/2/3 антитела или заешки IgG, а утаените протеини бяха имуноблотирани с анти-фосфо-Т359-S363 антитела ( ° С ). ( д - F ) Денатурираните R и M екстракти от PC-3mm2 клетки се обработват, както е описано на фигури 8а до c.

Изображение в пълен размер

Дискусия

RSK е широко изразен ефект надолу на каскадата MAPK. В това проучване ние демонстрираме, че както рекомбинантните RSK, така и RSK в яйцето на Xenopus екстрахират фосфорилират и трите изоформи на hCdc25 в консервиран мотив близо до каталитичния домен. В човешките клетъчни линии RSK за предпочитане фосфорилира Cdc25A и Cdc25B в митотични клетки. Фосфорилирането на RSK местата на hCdc25A и hCdc25B засилва тяхната активност, предизвикваща M-фаза. RSK-медиираното активиране на Cdc25 има положителна роля в прехода G2/M. Освен това RSK вероятно е по-активен в митотични клетки, отколкото в междуфазни клетки . Тези открития идентифицират нова връзка между активирането на каскадата MAPK и регулирането на прехода G2/M.

RSK включва семейство структурно свързани кинази, състоящо се от RSK1, RSK2, RSK3 и RSK4. Сред четирите изоформи RSK1, RSK2 и RSK3 са широко експресирани в човешки тъкани и клетъчни линии, 5,7,48 и е вероятно да фосфорилират припокриващи се субстрати. Следователно RSK, посочен в това проучване, включва поне RSK1, RSK2 и RSK3. Ние обаче знаем също, че различните RSK изоформи могат да имат различна роля в определени аспекти на клетъчната регулация. 59, 63 Следователно не можем да изключим възможността различните изоформи на RSK да допринасят по различен начин за фосфорилирането на hCdc25A и/или hCdc25B по време на прехода G2/M. Изясняването на този проблем ще изисква подробен анализ на различни изоформи. RSK във фосфорилирането на hCdc25A и hCdc25B in vitro и in vivo .