Обобщение

Шизофренията е често срещано и етиологично хетерогенно заболяване. Въпреки че наследяването на шизофреничните синдроми е сложно, тъй като генетичните и екологични фактори допринасят за клиничния фенотип, периодичната кататония, семеен подвид на кататонна шизофрения, изглежда се предава по автозомно доминиращ начин. Тук докладваме, че мутация Leu309Met в WKL1, позиционен кандидат-ген на хромозома 22q13.33, който кодира предполагаем неселективен катионен канал, експресиран изключително в мозъка, се секретира съвместно с периодична кататония в разширено родословие. Структурните анализи разкриват, че тази безсмислена мутация произвежда конформационни промени в мутантния протеин. Нашите резултати не само подчертават значението на генетичните механизми в етиологията на шизофреничните синдроми, но също така осигуряват по-добро разбиране на патогенезата и дезактивиращия ход на кататоничната шизофрения и свързаните с нея разстройства.

Достъпът е предоставен от

Главен

Периодичната кататония, семеен подтип на кататонна шизофрения (MIM 605419), е генетично хетерогенно разстройство, характеризиращо се с психоза и психомоторни разстройства. Пациентите с периодична кататония изразяват променлив фенотип, който съчетава акинетичен негативизъм, хиперкинеза със стереотипи и паракинетични движения, както и повишена тревожност, импулсивност и агресивност.1 Острите психотични епизоди могат да бъдат придружени от халюцинации и заблуди, докато епизодите Последователните сесии водят до все по-тежка кататония. остатъчен статус Въз основа на клинични доказателства за генетично очакване и кумулативен риск от заболеваемост от приблизително 27% при роднини от първа степен на пациенти, се прогнозира значителен генетичен ефект за някои форми на периодична кататония23.

Нашата група наскоро съобщи за сканиране на цял геном на 12 германски родословни с периодичен подтип на кататонна шизофрения, включващ 137 индивида, включително 57 засегнати.4 В тази проба бяха получени значителни доказателства за връзка на хромозома 15q15 чрез използване на непараметрични многоточечни методи за анализ (GENEHUNTER -PLUS LOD * резултат 3,57, P = 0,000026). За втори локус, поддържан главно от едно голямо семейство (Фигура 1), бяха намерени предполагаеми доказателства за връзка за маркер D22S1169 върху хромозома 22q13.33 (LOD * резултат 1,85, P = 0,0018). Генотипизирането на специфични полиморфни маркери за хромозома 22 стесни района на интерес за интервала на теломерите D22S1160, съдържащ c 4 cM (J Meyer et al, непубликувани данни). KIAA0027, частична cDNA, депозирана в GenBank5 с кратък и потенциално нестабилен CTG участък, беше сред няколко позиционни кандидати, разположени в този регион, които бяха избрани за допълнително разследване. Геномната анотация на KIAA0027 (въз основа на номера на присъединяване към GenBank D25217 за cDNA и AL022327 за геномния PAC клон RP3–355C18) разкри 12 екзона с обхват ∼ 28 Mb.

кодиращ

Сегрегация на алела C1121A в немско родословие с фамилна кататонична шизофрения. Засегнатите крайници са символизирани от черни диаманти. Мисенс мутацията кодира метионин (М) вместо остатък от левцин (L) аминокиселина. Предоставени са алели на два съседни полиморфни маркера (D22S1149 и D22S526). Отделна 8u10 ДНК не е налична за анализ на мутацията и следователно алелите са изведени от данните от сканирането на връзки. Хаплотипите, приети от починали лица, са дадени в скоби.

Изображение в пълен размер

Прогнозирана аминокиселинна последователност на WKL1 (номер за присъединяване на GenBank AF319633) и подравняване с KCNA1 (L02750). Подчертани са шест потенциални трансмембранни домена (S1-S6) и предполагаем порен регион (P). Показва се местоположението на мутацията Leu309Met в S6.

Изображение в пълен размер

Електроферограма, показваща последователността на част от екзон 11, разкрива C → A трансверсия в нуклеотидна позиция 1121 при пациент 8u12.

Изображение в пълен размер

Разширихме 5′-UTR на KIAA0027 в 5′-RACE до обща дължина на cDNA от 3515 базови двойки (номер за присъединяване GenBank AF319633). В разширения 5′-UTR е открит стоп кодон (TGA) в съобщената по-рано отворена рамка за четене.5 Следователно ATG кодонът в нуклеотидна позиция 197 трябва да се счита за правилното начално място на транслация, което води до 377 аминокиселинен остатък протеин (Фигура 4). Този нов протеин беше временно обозначен като WKL1.

Северен анализ на експресията на WKL1 в различни региони на мозъка и периферните тъкани.

Изображение в пълен размер

Северният анализ на WKL1 иРНК разкрива единична лента с размер не по-голям от 3,6 kb и транскриптите са открити изключително в човешкия мозък с най-висок интензитет на сигнала, открит в амигдалата, ядрото на каудатуса, таламуса и хипокампуса (Фигура 4). Размерът на WKL1 транскрипта е в съгласие с резултатите, получени с 5'-RACE техниката, въпреки че не може да се изключи съществуването на варианти на снаждане в различни области на мозъка или по време на невроразвитие. По-подробна оценка на експресията на WKL1, използвайки както северна, така и хибридизация in situ на човешкия мозък след смъртта, демонстрира транскрипти също в енторхиналната кора, путамен, substantia nigra и малкия мозък (A Schmitt et al, ръкопис в подготовка). В периферните тъкани, включително сърцето и скелетните мускули, не е открита експресия, която може да бъде открита.

Анализът на структурата на ревизирания протеин WKL1 разкрива шест предполагаеми трансмембранни домейни (S1-S6) с пореста област (P) между S5 и S6 (Фигура 2) .6 Въпреки че най-високите резултати за идентичност са получени за зависимия от напрежението шейкър на човека от калий -свързан канал KCNA1, 78, последван от други членове на това разширено семейство гени, характерни характеристики като сензора за напрежение в S4 и филтъра за селективност в областта P са слабо запазени.910 Тези характеристики предполагат, че протеинът WKL1 може да действа като не -селективен невронален катионен канал и следователно може да представлява първия член на ново подсемейство, отдалечено свързано със свръхсемейството, свързано с шейкъра калиев канал

Взети заедно, нашите резултати предоставят доказателство, че WKL1 хаплоинсуфицията причинява периодичен подтип на кататонична шизофрения. Мутацията Leu309Met е първата в патогенно значим ген, свързан с шизофренично разстройство, което е открито чрез анализ на връзката, последвано от позиционно клониране. Идентифицирането на ген, свързан с шизофрения, ще осигури мощен инструмент за разбиране на етиопатогенезата на кататоничната шизофрения и свързаните с нея разстройства. Разработването на причинно-следствени лечения за тези опустошителни и скъпи разстройства сега може да бъде реалистична перспектива и постижима цел.

Методи

Клинична

Мултиплексното семейство беше определено, както е описано по-горе.4 Проучването беше одобрено от Комитета по етика на университета във Вюрцбург и всички лица участваха след даване на информирано съгласие.

Мутационен анализ

Екзоните на гена WKL1 от пациенти и контроли се усилват в термоциклер T-GRADIENT (Biometra, Göttingen, Германия). PCR се извършва върху краен обем от 25 μl, съдържащ 60 ng геномна ДНК, 10 pmol от всеки праймер, 200 μM от всеки dNTP, 1.0 или 1.5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl (рН 8.3 при 25 ° ° С). C), 0,025 mg ml-1 BSA, 0,025% Tween 20 и 0,5 U Taq ДНК полимераза (Eurogentec, Seraing, Белгия). Получените PCR продукти бяха секвенирани с помощта на автоматизиран секвенсор ABI 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). За потвърждение и селекция на C1121A, екзон 11 се усилва от ДНК от 327 несвързани доброволци (654 хромозоми) и всички членове на семейството с изключение на индивида 8u10, чиято ДНК вече не е достъпна за това проучване. Праймерите за екзон 11 бяха 5'-TGGCTCGGTCACTTTTATTCC-3 'и 5'-CCCACAGGCTTCTCACCTC-3', съответно. PCR продуктите от семейството се анализират чрез смилане със Sfa NI и след това получените фрагменти се разделят върху агарозни гелове, оцветени с 2% етидиев бромид.

5′-състезание

За 5'-RACE, обща РНК се екстрахира от възрастен човешки хипокампус, използвайки разтвор на peqGOLD RNAPure (Peqlab, Erlangen, Германия). Синтезът на cDNA и 5'-RACE беше осъществен с помощта на Smart RACE комплект (Clontech, Palo Alto, CA, USA) съгласно инструкциите на производителя. Първоначално амплификация се извършва с специфични праймери 5'-CTGCTCTGC раса1 гени CGTTGGGAGCACTGG-3 'и 5'-GCCGTTGGG AGCACTGGTCTCTGGTCTGGGTGGTCTGG RACE2-3 ", последвано от PCR със специфични генетични semicentrada RACE3 праймер 5'-GGGTCTCGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTTGGGGTGGTGGGGTGGGGTGGGGTGG-3' сДНК на завършен WKL1 и дедуцирана аминокиселинна последователност бяха анализирани и сравнени с други подходящи гени, използвайки алгоритъма BLAST и софтуерния пакет MacVector. Предполагаемите трансмембранни домейни бяха предвидени, използвайки онлайн рутинни процедури за анализ на протеини, включително SMART (//smart.embl-heidelberg.de), EXPASY (// expasy. Proteome.org.au/tools/#align) и PSORT II (// psort. nibb.ac.jp).

Северно петно

Човешки Northern blot мембрани с еднакви количества поли A + mRNA (Clontech) от различни мозъчни региони и периферни тъкани бяха хибридизирани към 32-белязан с вложка IMAGE клон 3222221 (Ресурсен център, Берлин), съответстващ на ∼ 700 bp от 3 ' -край на гена WKL1, използвайки протокола, предоставен от производителя. Хибридизираните мембрани бяха изложени на фотографски филм (Kodak XR).

Израз на благодарност

Авторите искат да изразят своята благодарност към участниците в проучването и техните семейства. Те също така благодарят на P Riederer за споделянето на проби от човешки мозък, M Schartl и S Scherer за помощта им при анализа на протеини и C Müller-Reible за полезни дискусии.