Обобщение

Тук представяме протокол за предизвикване на депресия след инсулт при плъхове чрез запушване на средната церебрална артерия през вътрешната каротидна артерия. Използваме теста за принудително плуване на Porsolt и теста за предпочитане на захароза, за да потвърдим и оценим предизвиканите депресивни състояния на настроението.

Резюме

Въведение

Инсултът е четвърти в списъка с фатални заболявания в САЩ 1, 2, 3, докато причинява повечето увреждания при възрастни в развитите страни. 4; Това прави инсулта водещ претендент сред най-добрите здравни проблеми в света. Нормалността при оцелелите след инсулт е рядкост, като около 15% -40% от оцелелите жертви изпитват трайно увреждане, 20% се нуждаят от институционална помощ 3 месеца след началото на инсулт 5 и около една трета от 6-месечните оцелели, които се нуждаят от други, за да им помогнат всеки ден 6. Очевидно инсултът също представлява увеличение на националните разходи за здравеопазване 7. Оценките на Американската асоциация по сърдечни заболявания имат разходи за инсулт в САЩ над 50 милиарда долара през 2010 г. 8 .

Инсултът не само причинява дългосрочни щети на индивидите, но някои оцелели са склонни да страдат от емоционални и поведенчески разстройства, като деменция, умора, тревожност, депресия, делириум и агресия 9, 10, 11, 12, 13, 14. Най-често повтарящата се психологическа последица след инсулт е депресия след инсулт (PSD), диагностицирана при около 40% -50% от оцелелите 15, 16, 17. Депресията, предизвикана от инсулт, причинява повишена заболеваемост и смъртност 18, 19, 20, 21, 22. Патофизиологията на PSD не е напълно изяснена, но изглежда е причинена от множество фактори и е свързана с увреждане, когнитивно увреждане и мястото на нараняване 23 .

Моделът на фокална мозъчна исхемия на плъхове, създаден от Mcao, е най-разпространеният животински модел на инсулт 24, 25, 26, 27. Като се демонстрира индуцирането на PSD при плъхове чрез запушване на CSF чрез ICA, се използват техники, които минимизират смъртността и вариабилността в модела MCAO 28 .

Основната цел на този протокол е да очертае стъпките за индуциране на PSD при плъхове чрез блокиране на MCA чрез ICA, модифициран модел на MCAO, който намалява смъртността и води до променливост 28. Специфичните цели включват извършване на неврологични и хистологични изследвания (определяне на оценката на неврологичната тежест [NSS], обема на инфарктната зона и мозъчния оток), за да се провери ефикасността на MCAO и използването на поведенчески тестове за изследване на влиянието на тази MCAO процедура в развитието на емоционални разстройства, главно PSD.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Комитетът за грижа за животните от университета Бен-Гурион в Негев, Израел одобри всички процедури за лечение и тестване, използвани в този протокол.

1. подготовка на плъхове за експерименталната процедура

Забележка: Изберете възрастни мъжки плъхове Sprague-Dawley с тегло 300-350 g.

  1. Поставете плъховете, четири на клетка, във Вивариум при 22 ° C и влажност 40%, с обърнат 12-часов цикъл светлина/тъмнина (изключва се в 8:00 сутринта) и неограничен достъп до храна и вода.
  2. Случайно разпределете плъховете в две групи, а именно група MCAO (n = 24) и група Sham (n = 19).

2. подготовка на плъхове за операция

3. хирургия (техниката MCAO)

Забележка: Направете операция, както е описано от Boyko et al. 28 и използвайте инструментите, предоставени от McGarry et al. 29 и uluç et al. 30 .

  1. Направете вентрален разрез по средната линия и дисектирайте повърхностната фасция.
  2. Внимателно извършете рязка, силна дисекция в трите мускула с форма на триъгълник (стернохиоидния, дигастричния и стерномастоидния мускул), за да идентифицирате сънните артерии (TBI, ICA и общата каротидна артерия [CCA]).
  3. Внимателно направете дисекция и изложете правилните CCA и ICA.
  4. Отделете десния CCA и ICA от блуждаещия нерв.
    Забележка: Чрез идентифициране на сънните артерии, както е предвидено в стъпка 3.2, ICA ще бъде разпознат като половината от клоновете на CCA заедно с TBI.
  5. Поставете монофилна сонда (найлоново притъпена или силиконово покрита 4-0 найлон) директно през ICA,

4. следхирургично възстановяване

  1. Прилагайте 5 ml 0,9% физиологичен разтвор на всеки плъх интраперитонеално, веднага след операцията, за да предотвратите дехидратация.
  2. Прилагайте аналгезия безусловно на първия ден след операцията; използвайте мелоксикам 1 mg/kg SQ q24 часа. дайте разреден дипирон (0,5 g, разтворен в 400 ml питейна вода) на плъхове, показващи симптоми на болка през първите 3 дни.
  3. Пожертвайте всеки плъх с припадъци (припадъците са причинени от повишено вътречерепно налягане от мозъчен оток или мозъчен кръвоизлив 28).

5. оценка на неврологичната тежест 31

Забележка: Тази процедура се извършва от двама наблюдатели, които не участват в хирургичната процедура; те тестват за неврологични дефицити и изравняват двигателните дефицити с кумулативен резултат 0-4 32. Оценката на този резултат може да се направи на различни интервали от време; в това разследване то се извършва 50 минути, 24 часа, 7, 15 и 30 дни след операцията. Ето стъпките за оценка на сената. Въпреки че не е необходимост в тази ситуация, този резултат е необходим за определяне на инсулт при гризачи, за да се проведе лечение.

  1. Поставете плъха на керамичен под и го оставете да се движи свободно за 1 минута.
  2. Внимателно издърпайте плъха назад за опашката и оценете, както следва.
    1. Оценете плъха с резултат 0 за липса на неврологичен дефицит.
    2. Оценете плъха с оценка 1 за флексия на предните крайници.
    3. Вкарайте плъха с резултат 2 за контралатерален слаб захват на предните крайници.
    4. Оценете плъха с оценка 3, за да заобиколите паретичната страна, когато е хвърлен от опашката.
    5. Оценете плъха с оценка 4 за спонтанен кръг 32 .
      Забележка: Ако се наблюдават повече от една от реакциите, се дава предпочитание на действието с по-висок резултат.

6. определяне на инфарктния обем (хистологично изследване)

7. измерване на мозъчен оток 38

Забележка: Мозъчен оток е измерен 24 часа след последния MCAO. Евтаназират животни с тежък неврологичен дефицит, който пречи на храненето и/или пиенето в продължение на поне три дни, над 20% загуба на тегло, хемиплегия или гърчове.

  1. Оценете величината на отока на дясното полукълбо, като използвате сумата от коронално изрязани области, за да изчислите обемите на дясното и лявото полукълбо в произволни единици (пиксели).
    Забележка: Използвайте софтуера ImageJ 1.37 v за това изчисление след оптично сканиране (разделителна способност: 1600 x 1600 dpi). Изберете областта на интерес и използвайте функцията по размер в менюто анализ . В нашето изследване са използвани макроси.
  2. Изразете областта на мозъчния оток като процент от стандартните зони в незасегнатото контралатерално полукълбо.
  3. Изчислете степента на подуване, като използвате уравнението, разработено по-горе от 39 .

8. поведенчески парадигми

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Хистологични находки (маса 1) разкрива статистически значим обем на инфаркта като процент от общия мозък (p фигура 2А) и са имали по-голяма продължителност на неподвижност (p фигура 2B) В сравнение със симулирани плъхове.

запушване

Фигура 1: графична демонстрация на хронологията на протокола. Различните тестове, които се провеждат на плъхове по различно време, са показани на схемата: MCAO = запушване на средната мозъчна артерия в началото на експеримента; NSS = оценка на неврологичната тежест, 50 минути, 24 часа и 7 и 30 дни след MCAO; и поведенчески тестове (предпочитания за захароза и тестове за принудително плуване на Porsolt) в дни от 30 до 33 след MCAO. Тази цифра е променена от Ifergane et al. Четири пет . Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


Фигура 2: Тест за предпочитание на захароза, извършен от дни от 30 до 33 с пост-MCAO (n = 16) и плъхове с фалшив контрол (n = 14). Процент на предпочитание на захароза (%). Плъховете MCAO консумираха по-малко захароза (стр. 45. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


Фигура 3: Тест за принудително плуване на Porsolt, извършен от дни до 30 след MCAO (n = 16) и процедура след Sham (n = 14). Продължителност на неподвижност (в секунди). Времето за неподвижност в теста за принудително плуване беше значително по-дълго в групата MCAO, отколкото в групата на бутафорните (стр. 45. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Хистологични находки Група за запушване на средната церебрална артерия Група, управлявана от Sham
Общ мозък (обем на инфаркта) 8,8% ± 6,5 0,3% ± 0,1
Мозъчен оток 10,2% ± 4,6 2,6% ± 1,2
Всички данни представляват средно за групата ± S. E. M

Таблица 1: Хистологични находки за обема на инфаркта и мозъчния оток. MCAO = запушване на средната церебрална артерия (n = 5); Фалшив (n = 5).

Неврологична оценка на тежестта Група за запушване на средната церебрална артерия Група, управлявана от Sham
50 минути след операцията 2,75 ± 0,14 0,0 ± 0,0
24 часа след операцията 3,2 ± 0,15 0,0 ± 0,0
7 дни след операцията 0,91 ± 0,2 0,0 ± 0,0
Всички данни представляват средно за групата ± S. E. M

Таблица 2: Неврологична оценка на тежестта (NSS) за MCAO и фалшиви плъхове. MCAO = запушване на средната церебрална артерия (n = 16); Фиктивна (n = 14). Тази таблица е взета от Ifergane et al. Четири пет .

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Един от начините, по който MCAO техниката, представена тук, може да се счита за по-безопасна от оригиналния MCAO модел, се илюстрира от факта, че TBI и нейните клонове, включително тилната артерия, езиковия терминал и максиларната артерия, не са. Те са компрометирани чрез запушване на MCA чрез ICA. Закъснението на оригиналния модел на TCE MCAO (и неговите клонове), когато се дисектира дистално и коагулира в 46, причинява нарушено дъвчене, поради компромис със съдовото снабдяване на дъвкателните мускули 47. Разрушаването на мускула в крайна сметка може да доведе до освобождаване на допълнителна изчислителна динамика на течностите. Противно на оригиналната техника MCAO, при която достъпът до MCA се осъществява чрез TBI, описаната тук техника е модифицирана за инсулт, без прекъсване на кръвния поток в TCE и притоците му.

Най-важните аргументи за предпочитане на новия модел MCAO пред оригиналния MCAO се крият в способността му да намали значително вариабилността на мозъчния оток, обема на инфаркта и промените в теглото, както и да намали смъртността, свързана с MCAO. Смъртността при MCAO процедури е важен фактор 48; смъртност от 20% се счита за разумна 49, 50. Степените на смъртност (20% за оригиналния MCAO, 12,5% за новия MCAO и 0% за контрола) в настоящото разследване бяха в рамките на приемливия процент, но новата техника на MCAO беше по-добра от Оригинален MCAO.

Плъховете, подложени на новата MCAO процедура, са загубили по-малко тегло веднага след операцията и са натрупали повече килограми в края на разследването, отколкото плъховете, подложени на оригиналната MCAO 28 техника. Повече загуба на тегло и по-малко наддаване на тегло при плъхове, подложени на оригиналния MCAO, може да се получи от лиганд ACE по време на операция, причинявайки дистална хипоперфузия в лицевите, езичните и максиларните артерии, както и свързано с исхемия увреждане на мускулите, които поддържат дъвченето. Ако дъвченето се влоши, приемът през устата намалява, което, когато се комбинира с катаболизъм, може да доведе до загуба на тегло и в дългосрочен план до лош неврологичен резултат, заболеваемост и смърт 43. Достъпът до MCA чрез ACI не изисква намеса в TCE и неговите клонове. Следователно по време на новата процедура MCAO не се задействат пречки и плъховете, подложени на процедурата, не изпитват проблеми с теглото, заболеваемостта или смъртността.

Тестовете, използвани за оценка на основните депресивни фактори, като депресивно поведение, анхедония, обездвижване и нарушено учене и памет, са стандартизирани процедури, прилагани в животински модели на депресия 51, 52. Тестът за поведение, като теста за принудително плуване на Porsolt, обикновено се влияе от необичайни двигателни умения след MCAO. Тук този тест се прилага от 30 до 33 дни след хирургичната процедура, за да се определи, че индуцирането на PSD в модифицираните MCAO плъхове не е повлияло прекомерно моторните им умения. Според резултатите, плъховете в експерименталната група показват общо поведение при бягство, сравнимо с това на плъховете с фалшив контрол. MCAO плъховете са имали значително повече неуспехи при бягство, значително увеличена продължителност на обездвижване и намалено предпочитание към захароза в сравнение с фалшиво оперирани животни. Това предполага, че тази MCAO техника е способна алтернатива на оригиналния MCAO метод.

Разликата между включването и изключването на плъхове в процедурата MCAO за по-широка експериментална оценка зависи до голяма степен от резултата от операцията. С модела за индукция на PSD, свързан с MCAO, някои нежелани странични ефекти на MCAO могат да бъдат намалени, оставяйки място за включване на по-малки и евентуално крехки плъхове в процедурата MCAO. Представеният тук MCAO модел на животни предоставя сценарий за намаляване на нежелани резултати след индуциран от MCAO PSD, тъй като има потенциал да намали променливостта в промените в теглото, мозъчния оток и инфарктния обем, както и свързаните с тях смъртни случаи с MCAO. Тази техника може да служи като инструмент за оценка на бъдещи терапии с PSD и предоставяне на предклинични данни за ефикасността на терапевтичните вещества, както и за наблюдение на други фактори, които променят условията за клиничния резултат от инсулт и PSD.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.