Обобщение

Острата мозъчна травма е сериозно нараняване, което до момента не е било лекувано правилно. Мултифотонната микроскопия позволява надлъжно изследване на процеса на развитие на остра мозъчна травма и при изследване на терапевтични стратегии при гризачи. В този протокол са демонстрирани два модела на остра мозъчна травма, изследвани с in vivo двуфотонно изобразяване на мозъка.

Резюме

Въведение

Острата мозъчна травма е проблем на общественото здраве с висока честота на наранявания при инциденти с моторни превозни средства, падания или нападения и голямото разпространение на последващи хронични увреждания. Терапевтичните подходи за лечение на мозъчно увреждане остават напълно симптоматични, ограничавайки ефективността на доболничната, хирургичната и критичната помощ. Това прави социалното и икономическото въздействие на мозъчната травма особено тежко. По различни причини повечето клинични проучвания не показват подобрение на възстановяването след мозъчна травма, използвайки нови терапевтични подходи.

Животинските модели са от решаващо значение за разработването на нови терапевтични стратегии към етап, в който ефикасността на лекарството може да се предскаже при пациенти с мозъчно увреждане. Понастоящем има няколко добре установени животински модели на травма на главата, включително контролирано кортикално въздействие 1, перкусионно нараняване с течност 2, динамична деформация на кората 3, спадане на теглото 4 и фототравма 5. Редица експериментални модели са използвани за изучават някои морфологични, молекулярни и поведенчески аспекти на патологията, свързана с травма на главата. Въпреки това, нито един модел на животни не е пълен успех при валидиране на нови терапевтични стратегии. Разработването на надеждни, възпроизводими и контролирани животински модели на мозъчно увреждане е необходимо за оценка на сложни патологични процеси.

Тук предлагаме метода на стереотаксична пункция с игла на спринцовка, който може да се комбинира с едновременно локално приложение на лекарството, като усъвършенстван модел на локални мозъчни наранявания и като инструмент за изследване на патофизиологичните последици от острата травма в мозъка на бозайниците. in vivo.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички представени тук процедури са извършени в съответствие с местното ръководство за грижа за животните (финландски закон за експерименти с животни 62/2006). Лиценз за животни (ESAVI/2857/04.10.03/2012) е получен от местните власти (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Възрастни мишки на възраст 1-3 месеца, с тегло 24-38 g, се държат в отделни клетки в сертифицираните животински съоръжения на университета и винаги с храна и вода ad libitum.

1. Изобразяване на мозъчна травма през черепния прозорец

2. Изобразяване на мозъчни наранявания чрез разреден череп

0,5 до 1,5 mm в диаметър. Използвайте сгъстен въздух по време на пробиването, за да отстраните костните остатъци. Извършвайте пробиването периодично по време на процедурата за разреждане, за да избегнете прегряване, причинено от триене. Охладете дозата, като използвате разтвора до стайна температура и периодично нанасяйте буфер върху изтънената област, за да абсорбира топлината.
ЗАБЕЛЕЖКА: За да избегнете повреда на кората, не пробивайте в големи области (> 1,5 мм) на тънък слой (Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Оптимизирахме две оперативни процедури: 1) хроничен черепно-мозъчен прозорец и 2) изтъняване на черепа, чрез посттравматично изобразяване на мозъка при трансгенни мишки. Схематичен изглед на експерименталните препарати е представен в Фигура 1. Травматична пункция от 0,3 mm OD (30 g) стоманена игла се прилага върху пробитата ямка (Фигура 1А). Успешната подготовка на черепния прозорец позволява изображения на дълбочини до 650 м под повърхността на пиала (Фигура 1Б), докато изтъняването на черепа има тенденция да налага ограничение от приблизително 300 микрона (Фигура 1В), както е показано при 3D реконструкцията на кортикалните пирамидални неврони на мишка Thy1-YFP-H.

Пункционната травма води до отстраняване на дендрита и разрушаване на капилярните мрежи в контролиран обем на мозъчната кора. През първите два дни площта на нараняването се увеличава и травмата причинява дендритно обезцветяване и образуването на дендритна ретракция на луковицата в зоните на перилезия, както се наблюдава при използване на многофотонна микроскопия in vivo. (Фигура 2).

Изтъняването на черепа се извършва при активиране на изображението и миграция на микроглията при мишки CX3CR1-EGFP веднага след нараняване. (Фигура 3А). Изображенията SHG предлагат ценен инструмент за точно очертаване на мястото на нараняване (Фигура 3Б). Извънклетъчните матрични молекули, които произвеждат сигнали от групите за самопомощ, са значително обогатени в мозъчния паренхим при травма с иглени пръчки. Първо, фините микроглиални процеси се възстановяват, след което микроглиалните клетки мигрират до ръба на мястото на нараняване (Фигура 3А).

За да оценим възможните лезии, индуцирани от вмъкване на тънката стъклена пипета и доставяне на багрило, проведохме in vivo експерименти с двуфотонна микроскопия с микроинжекция на Sulforhodamine 101 в мишки Thy1-YFP-H без мозъчна травма. Представителните изображения са показани в Фигура 4 демонстрирайте кроеинжекция на миласит 3 часа след инжектирането. Следата от поставянето на пипетата може да се види в мозъчните обвивки, визуализирани от SHG (Фигура 4А). Астроцитите са маркирани със Sulphorodamine 101, въведен чрез инжектиране (Фигура 4Б). Дендритите, които експресират YFP под промотора Thy1, не демонстрират морфологични признаци на нараняване, като луковица или ретракция. (Фигура 4 ° С).

травма

Фигура 1. Метод за остро мозъчно увреждане в комбинация с препарати за тънки черепни прозорци или череп, комбинирани с in vivo двуфотонна микроскопия. ДА СЕ. Травматична пункция от 0,3 mm външна (30G) стоманена игла, приложена за сондаж на сондажи. Иглата се потапя за кратко в мозъка на 0,5-2 мм дълбочина от дъното на кладенеца. B, C . 3D реконструкция на кортикални пирамидални неврони на мишка Thy1-YFP-H в жълт и схематичен изглед на експериментални препарати. Сигналът за второ хармонично поколение от тънък череп (SHG) е показан в сиво (° С). д. Ярко зрително поле на повърхностни кръвоносни съдове през стъкления прозорец веднага след остра мозъчна травма. И. Разреден череп преди нанасяне на нараняване. Избраната област на интерес (бяла рамка) и точката на пробиване (червен кръг). Трябва да се изобрази различна област (червена кутия) на изтънената област, за да се проследи за възможни артефакти, индуцирани от операцията.


Фигура 2. Пример за надлъжно многофотонно изобразяване на развитието на мозъчна травма чрез изтънен череп. A. Paravista p на мястото на нараняване, заобиколено от маркирани с YFP дендрити на кортикални неврони 20 минути след причиняване на травма, както се отразява чрез изтънения черепен препарат. Б. Увеличеният изглед на областта, показана на панела А. С. Същата област на мозъка като в Б., преосветена 5 дни след травма. Дендритното бленбиране е показано с бели стрелки, дендритните ретракционни крушки - с червени стрелки.


Фигура 3. Примери за наблюдение на възпалението и активиране на глията по време на развитието на черепно-мозъчна травма, използвайки различни маркери, подходящи за in vivo изобразяване на протеини в мултифотон, напр. Флуоресцентен, багрилен и сигнал за генериране на втора хармоника. Изображенията са получени 3 часа след мозъчна травма. А. Активиране, експресиращо GFP на Microglia (зелено) и миграция след остро мозъчно увреждане, отразено през черепния прозорец при мишки CX3CR1-EGFP; второ хармонично поколение (SHG), показано в сиво. Б. Експресиращи GFP (зелено) и сулфородамин 101 (червени) астроцити в GFAP-EGFP мишки около мястото на нараняване, описани чрез силен сигнал за генериране на втора хармоника (сив) от молекули на извънклетъчната матрица. Стрелките показват примери за клетки на микроглия (ДА СЕ) и астроцити (Б) след нараняване. Граничното място на нараняването се идентифицира със знака на групите за самопомощ и е представено с пунктирана линия.


Фигура 4. Тест за удар на тъкани, направен чрез инжектиране на разтвора през стъклена микропипета. ДА СЕ. Следа (показана с пунктирана линия) в SHG, визуализираща мозъчните менинги 3 часа след инжектирането. Б. Мечени със сулфородамин астроцити, въведени чрез инжектиране. ° С. Дендрити, които експресират YFP под промотора Thy1. д. Комбинирано изображение на ДА СЕ (SHG - сиво), Б. (астроцити - червено), ° С (нервни дендрити - жълто).

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Мозъчната травма е внезапно непредсказуемо събитие. Тук описваме животинския модел, който възпроизвежда спектър от патологични промени, наблюдавани при човешки пациенти след мозъчно увреждане, като невродегенерация, отстраняване на дендрита, мозъчен оток, глиални белези, кръвоизливи в мозъчната кора, заедно с фокален субарахноиден кръвоизлив и повишена пропускливост кръвно-мозъчна бариера. За да се изследва първичната и вторичната патогенеза, както и възстановяването след травма, този модел на нараняване е комбиниран с надлъжна in vivo визуализация на добре невронални и глиални структури. Използвани са линии на трансгенни мишки, които експресират флуоресцентни протеини в неврони (Thy1-YFP-H) 7, астроцити (GFAP-EGFP) 8 или микроглия (CX3CR1-EGFP) 9. Освен това е използвано второ хармонично поколение (SHG) изобразяване и зареждане на астроцити със сулфародамин 101 10.

Моделът, описан тук, рекапитулира проникващ тип мозъчно увреждане. Следователно ограничение на този модел е, че той не предоставя информация за механизмите на затворена травма на главата. Наскоро Espada и съавтори съобщиха, че резултатите от многофотонното изобразяване в поведението на клетките в периконтузионната кора 6. Като се има предвид, че затворената травма на главата е по-чест медицински случай, методологичният подход, докладван от авторите, е много обещаващ да допълни традиционното изследване методи в областта на ударната мозъчна травма 11.

Използвахме както хроничния черепен прозорец 12, така и препаратите за изтъняване на черепа 13, за да изследваме клетъчното поведение при посттравматични състояния в живия мозък. И двата метода имат определени предимства и ограничения. По този начин хроничният черепен прозорец осигурява по-добра разделителна способност, оптично проникване по-дълбоко в мозъчната тъкан и комфорт за множество сеанси на изображения. За разлика от това, изтъняването на черепа е по-малко вероятно да предизвика възпаление на мястото на изобразяване и, може би по-важното, позволява многократно прилагане на лекарства и оцветители. Някои примери за фармакологични агенти, които се прилагат в този тип експерименти, са дадени в маса 1.

Таблица 1. Фармакологични средства и оцветители за кортикална инжекция в модела на пункционно нараняване.

Широк спектър от биохимични събития, които са изключително важни във физиологичните и патологичните състояния, могат да бъдат изследвани с химични инхибитори, флуоресцентни репортери и мутантни протеини, въведени чрез вирусни конструкции. Предимствата за избор на определен времеви прозорец, осигурен от препарата за изтъняване на черепа, могат да бъдат от голямо значение за проучванията.

В настоящото изследване използвахме сигнала за генериране на втора хармоника, за да очертаем зоната на лезията. Алтернативно, границите на мястото на лезията могат да бъдат обозначени със слабо дифузен флуоресцентен багрил, например флуоресцентен декстран конюгат с високо молекулно тегло (2 милиона Далтон).

Наскоро Schaffer и колеги 14 използваха хроничен препарат с отварящ се черепно прозорец за повтарящо се доставяне на флуоресцентни багрила в кората на мишката. Вероятно повторното отваряне на черепния прозорец може да повлияе неблагоприятно на прозрачността на мозъчната тъкан. От друга страна е трудно да се предскаже хода на възпалението, предизвикано от повторно отваряне, което може да повлияе на регенерацията на съединителната тъкан.

Голямо предимство на изтънения череп е способността да се доставят терапевтични съединения (и други материали, които изискват локално инжектиране в мозъчната тъкан) многократно по време на прогресията на травмата, без да се усложняват артефакти (например, без да се отваря отново черепният прозорец).

В случаите, при които не се изисква директен достъп до зоната на нараняване, силно се препоръчва да покриете изтънената област на черепа със стъкло за покриване, както е описано в статията за подготовка на полиран и подсилен изтънен череп от Kleinfeld и колеги 15. Това Може да се направи, като се използва следната незадължителна процедура. Поставете малка капка агароза (1,5%) върху изтънената област на черепа, изчакайте, докато се превърне в гел, отстранете цялата ненужна агароза, т.е. оставете я само на мястото на нараняването. Агарозата трябва да предпазва мястото на нараняване от външни ефекти. Изсушете областта на черепа, разредена със сгъстен въздух. Капнете малко количество акрилно лепило върху малко парче покривно стъкло № 0 и го поставете върху изтънената област на черепа. Полиакрилното лепило предотвратява възстановяването на костите и съединителната тъкан, като по този начин поддържа черепа изтънен под запазения прозорец.

Комбинация от тези процедури позволява изследване на остри и хронични посттравматични процеси, прилагане на лекарства по локален или системен път и директно проследяване на ефектите от лечението. Използването на двойни или тройни трансгенни линии на мишка също може да бъде от полза, особено за едновременно изобразяване на множество посттравматични процеси, като образуване на глиални белези и повторно израстване на невроните. Надяваме се, че нашите модели на остра мозъчна травма, изследвани с интравитална двуфотонна микроскопия, ще бъдат плодотворни за кандидатстване за наркотици.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.