Субекти

Обобщение

Въведение

Тук идентифицираме голяма група ASD-свързани de novo мутации в Rac1 активационния домейн на Trio, GEF1. Степента на мутационно групиране, която открихме в GEF1 домейна на Trio, и изчисленото предсказано въздействие на тези de novo мутации, свързани с ASD, върху взаимодействията на Trio-Rac1 предполагат силна връзка на дерегулация на пътя на Trio-Rac1 при свързани с ASD патологии. . Систематичното изследване на тези мутации в Trio-9 разкрива както хипоморфни, така и хиперморфни мутации, които драматично и двупосочно засягат функцията на Trio и влиянието на Trio върху глутаматергичната невротрансмисия в CA1 пирамидални неврони на хипокампуса. Животинските модели на TEA показват патологични увеличения и намаления на глутаматергичната невротрансмисия 17, 18, 19. Нашето проучване разкрива свързани с ASD мутации в един синаптичен Rac1 активиращ протеин, който може да доведе до двупосочни промени в глутаматергичната невротрансмисия и по този начин да доведе до намалена и прекомерна активност на Trio и произтичащата от това синаптична дисфункция при G-свързано заболяване.

Резултати

Мутации, свързани с ASD в Trio

мутация

De novo мутации, свързани с ASD в Trio. мисенс мутации, б глупости и номер на копие ° С в Трио при лица със заболявания, свързани с ASD. Посочени са различните протеинови домейни, започвайки с N термина: Sec14 домейн, Spectrin повторения, GEF1 домейн (съставен от Dbl (DH1) хомологичен домейн и Pleckstrin (PH1) хомологичен домейн), homc 3 домейн на Src (SH3), и GEF2 домейн (съставен от Dbl (DH2) хомологичен домейн и Pleckstrin (PH2) хомологичен домейн). За всяка мутация се предоставя диагнозата на индивида заедно с информация за промяната на аминокиселинната последователност на Trio. Положение на аминокиселинните мутации на NP_009049.2

Изображение в пълен размер

Според неотдавнашния анализ на Exome Aggregation Consortium (ExAC), базиран на 60 706 напълно секвенирани човешки генома, TRIO е един от 60-те най-ограничени човешки гени, което предполага голямо функционално значение. Trio има изключително нисък процент на безсмислени мутации (z = 6,29) и загуба на функция (LoF) безсмислени мутации (pLi = 1), докато има среден процент на синонимни мутации (z = 0,19) 27. Още по-изненадващо е ограничението в домейна GEF1/DH1. За отбелязване е, че не наблюдавахме мутации на миссенс или загуба на функция (LoF) в GEF1/DH1 домейн в 9 937 24 контролни генома (Таблица 1 и Фиг. 2а), което показва силно обогатяване на мутации, свързани с ASD в този регион ( Фиг. 2б). Също така не открихме мисенс мутации в GEF1/DH1 домейна в базата данни на 1000 генома 28 (допълнителна фигура 1а). Важното е, че синонимните мутации, изброени в базата данни 1000 генома, са присъствали в този регион (допълнителна фигура 1б). Взети заедно, тези данни сочат към силно обогатяване на свързани с ASD de novo мутации в GEF1/DH1 региона на Trio.

Таблица в пълен размер

Трио мутации, открити в контролни и свързани с ASD геноми. да се Мутации на Trio-9, открити в контролни геноми (от De Rubeis et al., 2014 24). б Графиката показва броя на мутациите, свързани с ASD (червени ленти) и контролни (черни ленти), открити във всеки домейн на Trio-9 при индивиди със свързани с ASD разстройства и съответно контролиращи индивиди без ASD разстройства. Обогатяването на свързаната с ASD Trio мутация във всеки Trio домейн се изчислява чрез изваждане на броя на контролните мутации от броя на de novo свързани ASD мутации, наблюдавани във всеки домейн. Прозрачните триъгълници илюстрират наличието (червено), отсъствието (черно) и величината на ASD-свързано обогатяване на мутация във всеки домейн.

Изображение в пълен размер

За да се оцени важността на мутациите на Trio протеин и Trio-GEF1/DH1 мутации при свързани с ASD разстройства, ние сравнихме очаквания брой de novo мутации с този, наблюдаван. Използваме мутационния модел, разработен от Samocha et al. 29. Резултатите от Samocha et al. се основават на 1078 случая на ASD и 151 случая на интелектуални увреждания и това проучване успя да идентифицира SCN2A и SYNGAP като значими при свързани с ASD заболявания. В настоящото проучване значително по-голям брой случаи (4890 за свързани с ASD разстройства) и големият брой безсмислени мутации, идентифицирани в TRIO (11 случая на ASD, в сравнение с 1,07 случая, очаквани за същия брой лица в общата популация) драстично подобри статистиката, което доведе до изключително значима асоциация на целия геном на TRIO с ASD-подобни синдроми (P-стойност от -8; допълнителна таблица 3). Открихме още по-силна връзка със синдромите, свързани с ASD, за поддомейн GEF1/DH1 на TR1, взаимодействащ с Rac1 (7 случая в сравнение с очакваните 0,06, стойност P -13; Допълнителна таблица 3).

ASD мутациите в Trio се очаква да променят активирането на Rac1

Прогнозирани ефекти на свързаните с ASD мутации DH1 върху активирането на Rac1. GEF1 домейнът в контекста на целия протеин е показан по-горе с GEF1 домейн, идентифициран с пунктиран червен квадрат. По-долу е даден преглед на структурата на комплекса Trio-GEF1 и Rac1, като двата интерактивни протеина са показани съответно като сини и оранжеви карикатури (Код на банката за протеинови данни 2NZ8). Мутиралите аминокиселинни остатъци при свързано с ASD заболяване са показани като сфери с пурпурно оцветени въглеродни атоми. Увеличените вложки представляват взаимодействия между аминокиселинни остатъци в див тип и мутантни протеини. Остатъците от див тип са етикетирани и показани в лентово представяне, с пурпурно оцветени въглеродни атоми. Мутиралите аминокиселини са показани със зелени или жълти въглеродни атоми. Водородните връзки/солевите мостове са показани като пунктирани линии. Водните молекули, участващи във взаимодействията GEF1-Rac1, са обозначени с прозрачни червени сфери

Изображение в пълен размер

Таблица в пълен размер

Експресията на Trio-9 I1329HLAL * инхибира синаптичната функция

Изображение в пълен размер

40% в амплитудата на AMPAR-eEPSC (фиг. 4h, j). Експресията на Trio-9 I1329HLAL * няма ефект върху амплитудата на NMDAR-eEPSC (Фиг. 4i, k). Този фенотип беше забележително подобен на този, наблюдаван при shRNA Trio. Сдвоеното улесняване на пулса (PPF) също не е модифицирано от постсинаптичната експресия на Trio-9 I1329HLAL *, което показва, че експресията на този мутант не е повлияла освобождаването на пресинаптичен глутамат (фиг. 4l).

Експресията на Trio-9 K1431M инхибира синаптичната функция

След това разгледахме мутацията на Trio missense, Trio-9 K1431M. Индивидът, който крие тази мутация, показва тежки аутистични симптоми и интелектуални затруднения. За отбелязване е, че предишно проучване, използващо мутации на сканиране с аланин, за идентифициране на важни остатъци в GEF1 региона на Trio, идентифицира този остатък заедно с R1428 като критичен за активиране на Rac1 36. Нашето моделиране на мутацията K1431M прогнозира нарушение в няколко взаимодействия, медиирани от вода и водород, което води до намален афинитет между GEF1/DH1 домейна на Trio и Rac1 (Фиг. 3 и Таблица 2). FLIM анализът разкри, че Trio-9 K1431M, подобно на Trio-9 I1329HLAL *, силно намалява способността на Trio-9 да активира Rac1 биосензора в клетки HEK293 (фиг. 5b). Следователно, както беше предсказано, активирането на Rac1 беше силно намалено от тази мутация. След това експресирахме Trio-9 K1431M в пирамидални неврони CA1 и установихме, че Trio-9 K1431M фенокопира Trio-9 I1329HLAL *. Trio-9 K1431M произвежда намаление от

50% в амплитудата на AMPAR-eEPSC (фиг. 5в), което вероятно е причинено и от увеличаване на тихите синапси, тъй като е имало намаляване на квантовото съдържание без промяна в амплитудата на NMDAR-eEPSC или промяна в PPF (фиг. 5d-f) . Както при дивия тип Trio-9, вариацията в амплитудите на NMDAR-eEPSC в експресиращите неврони Trio-9 K1431M се дължи на вариация в квантовото съдържание (допълнителна фигура 4в). Заедно тези данни показват, че Trio-9 K1431M, подобно на Trio-9 I1329HLAL *, вероятно се конкурира с ендогенния див тип Trio в синапсите и води до намаляване на AMPAR синаптичната функция. Освен това установихме, че безсмислена мутация в GEF1 домейна на Trio, която е идентифицирана при индивид без ASD (Trio-9 S1575N) 28, няма ефект върху способността на Trio-9 да увеличава амплитудата на AMPAR-eEPSC в невроните. пирамидален CA1 (допълнителни фигури 1а и 5).

Изображение в пълен размер

Експресията на Trio-9 P1461T инхибира синаптичната функция

Изображение в пълен размер

Trio-9 D1368V води до хиперфункция на Trio

Конкретната връзка на мутациите на Trio с ASD се подкрепя от анализ на нейния близък паралог, Kalirin, който има уникален профил на експресия на развитието. Не са наблюдавани ASD-свързани миссенс мутации в Kalirin, въпреки че играят подобна роля в регулирането на глутаматергичния синапс. Трио е силно изразено в ранното постнатално развитие и намалява с възрастта 10 години. За разлика от това, изразът на Калирин достига своя връх едва в юношеска възраст 11, 12. Трябва да се отбележи, че функцията на Kalirin е замесена в невропсихиатрични разстройства с късно начало като шизофрения и болест на Алцхаймер 38, 39, 40, 41. Глупостна мутация в GEF1/DH1 домейна на Kalirin, която инхибира активирането на Rac1, също е установена при индивид с шизофрения 39. Следователно, експресионните профили на Trio и Kalirin изглежда съвпадат с възрастта на поява на заболяванията, в които са замесени, и предполагат, че нарушаването на синаптичната регулация, медиирано от Rac1 в различни периоди от развитието на мозъка, води до различни заболявания, свързани с мозъка. .

Наскоро беше установено, че нарушенията в синаптичната Rac1-медиирана регулация на актини лежат в основата на развитието на поведенчески фенотипи, свързани с ASD, в добре установени животински модели на свързани с ASD заболявания 5, 6, 7. Неотдавнашно проучване също идентифицира Rac1 като вероятна точка на сближаване на редица рискови гени за ASD 8. Тук идентифицираме домена за активиране на Rac1 на регулаторния протеин на синаптичния актин, Trio, като гореща точка за свързани с ASD мутации de novo. Тъй като се смята, че дисрегулацията на глутаматергичната невротрансмисия лежи в основата на поведенческите фенотипи в много животински модели на ASD и тъй като не е установено, че протеините надолу по веригата на активността на Trio съдържат значителни мутации, свързани с ASD, е изкушаващо да се предположи, че променената функция на Trio представлява основна точка на сближаването на редица фактори, които пораждат ASD. Занапред ще бъде необходимо да се определи разпространението на променената функция на Trio при лица с ASD и да се установи дали терапиите, свързани с Trio, могат да се прилагат за обръщане на свързани с ASD поведенчески фенотипове при значителен брой лица с това заболяване.

Методи

Моделиране на мутации

Ефектът на мутациите върху стабилността и свързването се прогнозира, използвайки кристалната структура с висока разделителна способност на Trio GEF1 комплекс с Rac1 (PDB код 2NZ8). Изчисленията бяха извършени с помощта на софтуер за молекулярно моделиране на ICM (Molsoft LLC). Енергийната оптимизация на конформацията на мутантния протеин беше извършена с помощта на пристрастен вероятностен алгоритъм на Монте Карло. След това промяната на свободната енергия в стабилността на протеините ∆∆ G стабилност (1) и свързването с протеини ∆∆ G свързването (2) беше изчислена като разлика в сгъването или свързването на свободните енергии на мутантния и див протеин:

Мутациите или с bG свързване> 2, или с ∆∆G стабилност> 2 бяха предвидени като разрушителни за Trio активиране на Rac1.

Експериментални конструкции

Човешко Trio-9 (или Trio-9s в справка 13) е генерирано от Trio-FL cDNA, щедро предоставена от д-р Betty A. Eipper (Университет на Кънектикът). Свързаните с ASD Trio мутации са направени от Trio-9 cDNA, като се използва PCR с припокриване-удължаване, последвано от In-fusion клониране (Clontech). Всички плазмиди бяха потвърдени чрез ДНК секвениране. КДНК на Trio-9 бяха клонирани във pCAGGs вектор, съдържащ IRES-mCherry. Вектор pFUGW, експресиращ само GFP, се експресира съвместно с pCAGG-IRES-mCherry конструкции за подобряване на идентифицирането на трансфектирани неврони и се използва като контролен вектор за изобразяване на гръбначния стълб. Конструкцията на биосензор Rac1 е в рамките на pTriEx-HisMyc гръбнак, както е описано по-рано в реф. 30 и беше предоставен щедро от д-р Яап Д. ван Буул (Sanquin).

HEK293 клетъчна трансфекция

Клетките HEK293T (ATCC) се култивират в DMEM с 10% FBS в 37 ° С инкубатор, снабден с 5% CO 2. Клетките се поставят върху 35 mm стъклени дънни плочи, покрити с Matrigel. Клетките се отглеждат до 50% сливане, преди да бъдат трансфектирани с експресионните конструкции Trio-9 заедно с биосензора Rac1, използвайки реагент за трансфекция FuGENE HD. Използвано е съотношение на биосензорна ДНК Trio-9/Rac1 от 1: 1. Покритите клетки се инкубират в трансфекционната смес в продължение на 16 часа и след това се заменят с прясна среда. Проведени са експерименти с HEK293

20 часа след трансфекцията.

Флуоресцентно изображение през целия живот (FLIM)

$$ E = 1 - \ tau DA> \ tau D $$

Фазорът на FRET биосензора в отсъствие на активатора се получава от независим препарат. Фазорът, съответстващ на потушения донор, се изчислява съгласно уравнението за охлаждане (3). Позициите на всички възможни фазори, които се гасят с различна ефективност, описват извита траектория във фазовия график. Експерименталната позиция на фазора на даден пиксел по траекторията определя количеството на охлаждане и следователно FRET ефективността. Приносът на фона и на донора без акцептор се оценява, като се използва правилото на линейната комбинация 49, 52, като фоновият фазор и донорът неугасени се определят независимо. Всички фазови трансформации и анализът на данните от FLIM данни бяха извършени с помощта на софтуера SimFCS (Калифорнийски университет, Ървайн).

Електрофизиология

Анализ на плътността на гръбначния стълб

За анализ на плътността на гръбначния стълб, контролни и експериментални CA1 пирамидални неврони в органотипични култури на хипокампални резени, направени от P6 кученца плъхове, са биологично трансфектирани с FUGW-GFP и pCAGGS-IRES-mCherry конструкции приблизително 18–20 h след посяването. Изображенията са получени на DIV 7, като се използва микроскопия със супер разделителна способност (Elyra Microscope System, Zeiss). За използване с наличния обърнат микроскоп и обектив с обектив за потапяне в масло, резените бяха фиксирани в 4% PFA/4% захароза в PBS и измити 3 пъти с PBS. За усилване на GFP сигнала, резените след това бяха блокирани и проникнати в 3% BSA в PBS, съдържащ 0,1% Triton-X и оцветени с първично антитяло срещу GFP (2 μg/ml, Life Technologies A-11122), последвано от измивания в PBSTx и оцветяване с конюгирана с Alexa 488 вторична (4 μg/ml, Life Technologies A-11034). Филийките бяха допълнително обработени със съкратен протокол 55, базиран на SeeDB, в опит да се намали сферичната аберация. След това резените бяха монтирани в SlowFade Gold (Life Technologies) за изображения. Z-стековете са направени от 30 µm участъци от вторични апикални дендрити

30 µm от сомата. Изображенията са получени със 100 × маслена цел (100 ×/1,46) в режим SIM с помощта на предоставена 42 μm SIM решетка и са обработени и реконструирани с помощта на доставения софтуер (Zen, Zeiss). Експериментатор, заслепен за състоянието на изображението, извърши анализ на изображението на отделни секции, използвайки ImageJ за преброяване на бодли, простиращи се странично от дендрита.

Статистически анализ

За статистиката на мутациите, свързана с ASD в Trio, използвахме прост тест на Поасон, подобен на този, използван в Samocha et al. 29. Очакваният брой de novo мутации в Trio протеин при 4890 индивида със свързани с ASD разстройства е изчислен въз основа на генно-специфична мутация на вероятността, определена от Samocha et al. Очакваният брой de novo мутации в Trio-GEF1/DH1 домейна се изчислява чрез преоразмеряване на очаквания брой мутации в Trio с допускане на еднаква вероятност за мутация по гена. Използван е праг на значимост за целия геном P-стойност от -6. За сдвоени електрофизиологични записи на амплитуда на eEPSC е използван тест за подредени рангове на Wilcoxon за сдвоени данни. Тестовете на Wilkoxon Rank Sum бяха използвани за сравняване на електрофизиологичните данни при независими условия. Измерванията за улеснение на сдвоени импулси и данни за плътността на гръбначния стълб бяха анализирани, като се използва съответно сдвоен и несдвоен t-тест на Student. Всички проведени статистически тестове бяха двустранни и с всички тестове P-стойност от