УНИВЕРСИТЕТ В ГРАНАДА. УЧИЛИЩЕ ПО МЕДИЦИНА. КАФЕДРА ЗА ФИЗИОЛОГИЯ ДОКТОРАЛНА ТЕЗА СОЛНА СЕНЗИТИВНОСТ В ЕКСПЕРИМЕНТАЛЕН ХИПЕРТРОИДИЗЪМ И ФУНКЦИЯ И ЕКСПРЕСИЯ НА НАТРИЕВИ ТРАНСПОРТЕРИ ПРИ ПЛЪХОВЕ С ДИСФУНКЦИЯ НА ТИРОИД ROCÍO PÉREZ ABÚD Гранада, 2012
Редактор: Редакция на Университета в Гранада Автор: Rocío Pérez Abúd D.L.: GR 2331-2012 ISBN: 978-84-9028-105-5
JOSÉ FÉLIX VARGAS PALOMARES, КАТЕДРАТИЧЕН НА ФИЗИОЛОГИЧНИЯ ОТДЕЛ НА УНИВЕРСИТЕТА В ГРАНАДА. Той удостоверява: че работата, извършена при подготовката на докторската дисертация, озаглавена: Чувствителност към сол при експериментален хипертиреоидизъм и функция и експресия на натриеви транспортери при плъхове с нарушена функция на щитовидната жлеза, представена от Rocío Pérez Abúd, е извършена под мое наблюдение и посока, отговаряща на академичните условия, необходими за представянето им, за да се класират за докторска степен. И за протокол, където е подходящо, подписвам това в Гранада, 26 януари 2012 г. Подписано. Хосе Феликс Варгас Паломарес
АНТОНИО ОСУНА ОРТЕГА, РЪКОВОДИТЕЛ НА НЕФРОЛОГИЧНАТА СЛУЖБА НА УНИВЕРСИТЕТНАТА БОЛНИЦА ДЕВА ЛА НИВЕС. Той удостоверява: че работата, извършена при подготовката на докторската дисертация, озаглавена: Чувствителност към сол при експериментален хипертиреоидизъм и функция и експресия на натриеви транспортери при плъхове с нарушена функция на щитовидната жлеза, представена от Rocío Pérez Abúd, е извършена под мое наблюдение и посока, отговаряща на академичните условия, необходими за представянето им, за да се класират за докторска степен. И за протокола, където е подходящо, подписвам това в Гранада, 26 януари 2012 г. Подписано. Антонио Осуна Ортега
JUAN MANUEL MORENO AYUSO, ПРОФЕСОР НА КАФЕДРА ПО ФИЗИОЛОГИЯ НА УНИВЕРСИТЕТА В МУРЦИЯ Удостоверява: че работата, извършена при подготовката на докторската дисертация, озаглавена: Чувствителност към сол при експериментален хипертиреоидизъм и функция и експресия на натриеви транспортери при плъхове с тиреоидна дисфункция, представени от Rocío Pérez Abúd, са извършени под мое ръководство и ръководство, отговарящи на академичните условия, необходими за представянето им, за да се класират за докторска степен. И за протокол, където е подходящо, подписвам това в Гранада, 26 януари 2012 г. Подписано. Хуан Мануел Морено Аюсо
Резултатите от тази докторска дисертация са публикувани в: Pérez-Abúd R, Rodríguez-Gómez I, Villarejo AB, Moreno JM, Wangensteen R, Tassi M, O'Valle F, Osuna A, Vargas F. Солевата чувствителност при експериментални нарушения на щитовидната жлеза при плъхове. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2011 август; 301 (2): E281-7. Epub 2011 април 26. Moreno JM, Pérez-Abúd R, Wangensteen R, Rodríguez Gómez I, López Merino I, Osuna A, Vargas F. Функция и експресия на бъбречни епителни натриеви транспортери при плъхове с тиреоидна дисфункция. J Endocrinol Invest. 2011 8 ноември.
На родителите ми, на Мартин и Лурд
Съдържание I. ВЪВЕДЕНИЕ. 1 1. БИОЛОГИЧНИ ПРОМЕНИ В ХИПО И ХИПЕРТИРОИДИЗЪМ. СЪРДЕЧНО-СЪДОВИ И БЪДЕЩНИ ПРОЯВИ. 3 1.1. Сърдечно-съдова функция 3 1.1.1. Хемодинамични промени. 3 1.1.2. Сърдечна хипертрофия. 4 1.2. Бъбречна функция. 7 1.2.1. Бъбречна маса и управление на натрия в бъбреците. 7 1.2.2. Бъбречен кръвоток и скорост на гломерулна филтрация. 9 1.2.3. Протеинурия 10 1.3. Оксидативен стрес при хипертиреоидизъм. 11 1.4. Азотен оксид при дисфункция на щитовидната жлеза. 12 1.4.1 Азотен оксид синтаза. 12 1.4.2. Ефекти от NOS блокада при хипертиреоидизъм. 14 2. ХИПЕРТЕНЗИЯ ПО СЛУЧАЙНОСТТА НА СОЛТА. 17 2.1. Общи положения. 17 2.2. Сол и азотен оксид. 20 2.3. Сол и оксидативен стрес. 23 2.4. Сол и възпаление. 26 2.4.1. Тубуло-интерстициално възпаление и хипертония. 26 2.4.2. Оксидативен стрес и активиране на възпалителни фактори. 27 2.4.3. Прием на сол и трансформиращ растежен фактор или TGF-β1. 28 I
Индекс 3. ТРАНСПОРТИРАНЕ НА НАТРИЕВ СРЕД НЕФРОНА. 29 3.1. Регулиране на NaCl и реабсорбция на вода. 34 3.2. Транспорт на натрий в специални ситуации. 36 3.2.1. Чернодробна цироза. 36 3.2.2. Бременност. 37 3.2.3. Хипертония поради чувствителност към сол. 38 3.2.4 Дефицит на тиреоиден хормон. 39 3.2.5. Хипертиреоидизъм 42 II. ПОДХОДИ И ЦЕЛИ. 45 III. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ. 51 1. Използвани наркотици и инструменти. 53 1.1. Наркотици. 53 1.2. Инструменти. 54 2. Експеримент 1. Чувствителност към сол при експериментален хипертиреоидизъм. 55 2.1. Животни и разпространение. 55 2.1.1 Експериментален протокол. 56 2.1.2 Определяне на систолното налягане чрез опашна плетизмография. 57 2.1.3 Катетеризация на бедрената артерия. 58 2.2. Аналитични процедури. 58 2.2.1. Определяне на протеинурия. 58 2.2.2. Определяне на аминопептидази. 59 2.2.3. Определяне на цитокини. 60 2.2.3. Хистопатологично изследване. 60 Морфометрично изследване. 60 II
Индекс 3. Експеримент 2. Функция и експресия на натриеви транспортери при плъхове с дисфункция на щитовидната жлеза. 61 3.1. Животни и разпространение. 61 3.1.1. Експериментален протокол. 62 3.2. Аналитични процедури. 63 3.2.1. Подготовка на тъкани за Western blots. 63 3.2.2. Електрофореза и уестърн петна от мембранни протеини. 64 3.2.3. Получаване на обща РНК. 65 3.2.4. Обратна транскрипция и полимеразна верижна реакция в реално време (RT-PCR). 65 4. Статистически анализ. 66 IV РЕЗУЛТАТИ. 69 1. Експеримент 1. Чувствителност към сол при експериментален хипертиреоидизъм. 71 1.1. Кръвно налягане и сърдечна честота. 71 1.2. Морфологични променливи. 72 1.3. Плазмени променливи и нива на хормони на щитовидната жлеза. 73 1.4. Уринарни и метаболитни променливи. 75 1.5. Екскреция на нитрити и нитрати. 77 1.6. Променливи на оксидативния стрес. 78 1.7. Уринарни аминопептидази. 79 1.8. Морфометрични резултати. 81 1.9. Променливи на възпалението в бъбречната кора. 81 2. Експеримент 2. Роля и експресия на бъбречни транспортери на натрий при дисфункция на щитовидната жлеза. 82 2.1 Биологични променливи. 82 III
Индекс 2.2. Пикочен отговор на хипертонично и изотонично интраперитонеално физическо натоварване при физиологични плъхове с хипотиреоидна и хипертиреоидна система 83 2.3. Бъбречен отговор на ацетазоламид при плъхове в съзнание и концентрация на протеин и експресия на NHE3 иРНК. 85 2.4. Бъбречен отговор на фуроземид при съзнателни плъхове и концентрация на протеин и експресия на NKCC2 иРНК. 86 2.5 Бъбречен отговор на хидрохлоротиазид при плъхове в съзнание и концентрация на протеин и експресия на TSC иРНК. 2.6. Бъбречен отговор на амилорид при съзнателни плъхове и количество протеин и експресия на αenac иРНК. 89 V. ДИСКУСИЯ. 91 VI. ЗАКЛЮЧЕНИЯ. 113 VII. БИБЛИОГРАФИЯ. 117 IV
Въведение сърдечна хипертрофия при хипертиреоидизъм. В подкрепа на това предложение, проучвания, проведени в култури на кардиомиоцити, показват, че хормонът на щитовидната жлеза контролира директно експресията на гените и растежните фактори (Morgan and Baker, 1991). Таблица 1. Хемодинамични променливи при експериментален хипер и хипотиреоидизъм Групи Хипертиреоидизъм Хипотиреоидизъм Морфологични променливи Телесно тегло Тиреоидно тегло Камерно тегло Бъбречно тегло Камерно тегло/телесно тегло Бъбречно тегло/телесно тегло Лява камера/вентрикула Десни хемодинамични променливи Кръвно налягане Кръвен обем Сърдечен изход Общо периферно съпротивление Сърце скорост Пулсово налягане 2. Бъбречна функция 1.2.1 Бъбречна маса и управление на натрия в бъбреците Има данни, че хипотиреоидизмът намалява, а хипертиреоидизмът увеличава теглото на бъбреците спрямо телесното тегло. Този механизъм не е напълно ясен, но изглежда, че участва SRA. Нарушенията на щитовидната жлеза имат важен ефект върху бъбречната функция и метаболизма на хидрозалина (Michael et al., 1972; Bradley et al., 1974; Emmanuel et al., 1974). Хипотиреоидизмът, индуциран от тиреоидектомия или химически средства, генерира 7
Въведение, че няколко проучвания, описващи умерено повишаване на кръвното налягане с висок прием на сол при плъхове Sprague-Dawley (Wang et al., 1996; Ni and Vaziri, 2001; Newaz et al., 2005), солта също увеличава сърдечната честота, пулсовото налягане, изопростани в урината, NO метаболити на NO (NOx), вазопресин, ендотелин и протеинурия. Други проучвания обаче не откриват значителни промени в кръвното налягане при плъхове Sprague-Dawley с висок прием на сол (Debinski et al, 1990; Osborn и Hornfeldt, 1998). Тези несъответствия могат да отразяват разликите в продължителността на лечението или в начина на приложение (в храната или питейната вода). Таблица 2. Проучвания, проведени при плъхове от различни автори с диети, богати на сол, фураж или питейна вода АВТОР (SAL) RATA P.A. МЕТОД T Banday (2007) Sankaralingam (2006) Gu (2006) Kobori (2003) Lenda (2000) Osborn (1998) 1% вода SD - Директно 12 дни 0,9% вода SD Indirect 3 седмици 4% Dhal-SS Indirect 5 седмица 8 % Dhal-SS Indirect 4 седмици 7% SD - Директно 3-4 седмици 4% SD Директно 5-7 седмици 19
Въвеждане на кръвно налягане чрез намаляване на общото периферно съпротивление и увеличаване на отделянето на NaCl с вода с урината. В допълнение, PNA и PNB също намаляват секрецията на ADH от задната част на хипофизата (Berne and Levy, 2009). Фигура 1: Транспортери по нефрона Урогуанилин и гуанилин се произвеждат от невроендокринни клетки в червата в отговор на поглъщането на NaCl през устата. Тези хормони навлизат в циркулацията и инхибират реабсорбцията на NaCl и водата чрез бъбреците чрез активиране на мембранно свързани гуанилил циклазни рецептори, които увеличават вътреклетъчно (cGMP). Катехоламините стимулират реабсорбцията на NaCl във всичките четири сегмента на нефрона. Въпреки че симпатиковите нерви не се активират, когато обемът на LEC е 35
II. ПОДХОДИ И ЦЕЛИ
Подходи и цели На този фон целите на настоящата работа са: Да се изследва възможната модулираща роля на тиреоидните хормони върху чувствителността на солта при плъхове, анализирайки отговора на PS, морфологични променливи, бъбречна функция и оксидативен стрес при хипер е хипотиреоид с повишено прием на сол. Да се определят ефектите от хипер- и хипотиреоидизъм върху функцията на най-важните бъбречни транспортери на натрий (NHE3, NKCC2, NCC и ENaC) и тяхната корелация с експресията и количеството на тези протеини. 49
III. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
Материали и методи 1. Използвани лекарства и инструменти 1.1 Лекарства Ацетазоламид Солна киселина Трис аланил-β-нафтиламид Говежди серумен албумин Амилорид Козе анти-заешко конюгирано вторично антитяло Заешки поликлонални антитела Аспартил-β-нафтиламид Цистинил-Sigor-β-нафтиламид-β-нафтиламид -нафтиламид) диетилтриетидий диметилсулфоксид етанол етилов етер формалдехид фуроземид глутамил-β-нафтиламид хидрохлоротиазид протеаза инхибитор изопропилов алкохол метимазол NaCl NaOH 53
Материали и методи Oligos PBS (Sigma) Пентобарбитал натрий Изотоничен физиологичен разтвор TRIzol разтвор Захароза Хепаринизиран физиологичен разтвор Ацетатен буфер Триосновен физиологичен буфер Тироксин (Merck). 1.2. Инструменти Имунолит 2000 Автоанализатор Баланс (Sartorius, Pacisa). Центрофуга (Григел). Фризер -80Cº Спектрофотометър. Печка (Selecta). 000 конци за конци. Индивидуални метаболитни клетки (Tecniplast Gazzada, COD). Лабораторно оборудване за плетизмограф (Letica). Политрон 54