диагностичен

  • Обобщение
  • Главен
  • материали и методи
  • Проби от тъкани
  • Тъканни матрици
  • Анализ на Western Blot
  • Имунохистохимично оцветяване
  • Резултати
  • Дискусия

Обобщение

Главен

Ракът на неизвестен първичен сайт е седмият до осмият най-често срещан рак в клиничната практика. 1 Годишната честота, коригирана с възрастта на 100 000 население, е от 7 до 12 случая в САЩ, 18 в Австралия и 6 в Холандия. Това е четвъртата най-честа причина за смърт от рак както при мъжете, така и при жените. 2 Тъй като оптималното лечение на рака е свързано с мястото на първичния тумор, липсата на идентифициране на първичното място създава значителни проблеми по време на лечението на пациентите. Аденокарциномите представляват почти половината от всички неизвестни първични ракови заболявания. Използването на имунохистохимия за откриване на специфични антигени върху туморни клетки доведе до значително подобрение в диагностиката на раковите заболявания. Например, специфичен за простатата антиген се използва като маркер за рак на простатата. 3 Транскрипционният фактор на щитовидната жлеза е маркер за рак на белия дроб. 4 Все още обаче липсва добър маркер за стомашно-чревни (GI) тумори.

Кадхерин-17, наричан още чернодробно-чревен кадхерин или човешки пептиден транспортер-1, е член на суперсемейството на кадхерин и е адхезионна молекула, зависима от Са2 +. 5, 6 За разлика от така наречените класически кадхерини, като E, N и P кадхерини, кадхерин-17 има седем повторения на кадхерин вместо пет в извънклетъчния домен и само 20 аминокиселинни остатъка в цитоплазмения домен. Значително късият цитоплазмен домен няма хомология с други кадерини и адхезивната функция на кадхерин-17 не зависи от асоциацията с други цитоплазмени протеини. 7 Клетъчното разпределение на кадхерин-17 също се различава от класическите кадхерини. В чревните епителни клетки Е-кадхеринът е концентриран в прилепналите връзки, докато кадхерин-17 е равномерно разпределен по страничната контактна зона. 8

Разпределението на тъканите на кадхерин-17 се различава по видове. При плъхове кадхерин-17 се експресира в черния дроб и чревните епителни клетки. При хора и мишки експресията е ограничена до чревни епителни клетки и не се открива в черния дроб. 9 Ограниченото разпределение на 17-кадхерин в нормалните тъкани предполага, че той може да бъде полезен маркер за идентифициране на първични туморни места. Съобщава се, че Cadherin-17 се изразява в колоректален рак, рак на стомаха, 11, 12 и панкреас. 13 Не е известно дали се изразява в тумори в други органи.

Следователно, в това проучване ние изследвахме експресията на кадхерин-17 в тумори, получени от различни места в тялото, използвайки тъканни матрици. Установихме, че кадхерин-17 е дифузно и силно експресиран в колоректални аденокарциноми, разпръснат експресиран в аденокарциноми на стомаха, панкреаса и жлъчния канал и практически не е експресиран в тумори другаде в тялото. Нашето проучване показва, че кадхерин-17 може да бъде полезен маркер за идентифициране на първични места на метастатични аденокарциноми.

материали и методи

Проби от тъкани

Фиксирани с формалин, вградени в парафин тъканни блокове са получени от 518 преди това характеризирани първични карциноми и 60 нетуморни тъкани от архивите на Катедрата по патология, Национална болница на Тайванския университет. Изследването е проведено в съответствие с насоките на нашия институционален съвет за преглед. Тези случаи на тумор включват 44 рака на гърдата, 39 цервикални карциноми, 33 холангиокарциноми, 47 колоректални карциноми, 57 хепатоцелуларни карциноми, 50 рак на белия дроб, 47 бъбречно-клетъчни карциноми, 89 рак на яйчниците, 28 рак на панкреаса, 39 рак на бъбреците. рак Спектърът на изследваната нетуморна тъкан е посочен в таблица 1.

Таблица в пълен размер

Тъканни матрици

Целевите области на тъканите бяха маркирани върху оцветени секции H и E. За всеки случай се отстранява 2 mm тъканна сърцевина с помощта на ръчно устройство за тъканна матрица (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA) и се вкарва в рецепторен парафинов блок. Събраните тъкани се нарязват на филийки с дебелина 4 μm и се поставят върху позитивно заредени предметни стъкла.

Анализ на Western Blot

Уестърн петна се извършват върху протеинови лизати от 11 представителни нормални и туморни тъкани, включително бъбреци, черен дроб, дебело черво, тънки черва, стомах, далак, щитовидна жлеза, панкреас, плацента и карциноми на яйчниците и белите дробове. Подобни количества от общия протеин от всеки лизат се разделят с използване на поликриламидни гелове Tris-глицин-SDS-8% (Novex, Сан Диего, Калифорния, САЩ) и след това се прехвърлят в мембрани от поливинилиден дифлуорид на Impobilon-P от Millipore. Мембраните бяха сондирани с миши моноклонални анти-кадхерин-17 антитяло, клон 1H3 (IgG1), в концентрация 1 μg/ml (Abnova, Тайпе, Тайван), последвано от конюгирана с пероксидаза кози антимиши имуноглобулин (1: 2500 ). Western blots са разработени с помощта на хемилуминесценция (Pierce, Rockford, IL, USA).

Имунохистохимично оцветяване

Тканевите секции бяха депарафинизирани и рехидратирани. Възстановяването на антигена се извършва чрез инкубиране на предметните стъкла в 0,01 М буфер с лимонена киселина (рН 6,0) при 100 ° С за 10 минути. След блокиране с 3% H2O2 и 5% фетален говежди серум, предметните стъкла реагираха с моноклонално антитяло срещу кадхерин-17 (клон 1H3, Abnova), цитокератин 7 (DakoCytomation, Glostrup, Дания), цитокератин 20 (DakoCytomation) или CDX -2 (Biogenix, Сан Рамон, Калифорния, САЩ) при разреждане 1: 100 при 4 ° С за една нощ. Слайдовете се инкубират с полимер-HRP реагент (BioGenex). Пероксидазната активност се визуализира с разтвор на диаминобензидин тетрахидроксихлорид (BioGenex). Срезите бяха оцветени с хематоксилин. Тъмнокафявото мембранно оцветяване беше определено като положително и нито едно оцветяване не беше определено като отрицателно. За отрицателни контроли заменихме първичното антитяло с 5% фетален говежди серум. Оцветяването се оценява по следния начин: 0 (няма откриваемо оцветяване); 1+ (75%). В клетките с положително оцветяване оцветяването е интензивно и еднородно, поради което интензитетът не се взема предвид в резултата.

Резултати

Първо определихме специфичността на анти-кадхерин-17 антитялото (клон 1Н3) чрез Western blot анализ. Експресията на Cadherin-17 се открива изключително в човешки лизати на тънките черва и дебелото черво, а не в лизати на други нормални тъкани и тумори (Фигура 1). Антитялото е специфично за протеина кадхерин-17, тъй като в лизатите на тънките черва и дебелото черво присъства единична лента с привидно молекулно тегло приблизително 110 kDa. Тази лента съответства на протеина кадхерин-17. Няма откриваема кръстосана реактивност с други протеини, както се разкрива от Western blot анализ.

Western blot анализ на протеина кадхерин-17 в тъканните лизати. Във всяка лента бяха заредени равни количества протеин (25 ug). Сред тези тумори само дебелото черво и тънките черва експресират протеина кадхерин-17. Cadherin-17 се разглежда като единична лента с молекулно тегло 110 kDa.

Изображение в пълен размер

Таблица 1 показва разпределението на кадхерин-17 в нормалните тъкани чрез имунохистохимия в проби от тъканни матрици. Силно дифузно мембранно оцветяване на кадхерин-17 се наблюдава в чревния епител, включително проби, взети от тънките черва, апендикса и колоректалната лигавица (Фигури 2а и б). Cadherin-17 се експресира в повърхностния епител на дванадесетопръстника, но не и в жлезата на Brunner. Кадхерин-17 не се експресира в нормална стомашна лигавица (Фигура 2в), но се наблюдава в области с чревна метаплазия. Нито един друг тип тъкан не е имал откриваема експресия на кадхерин-17 (Фигури 2d-f).

Имунохистохимично оцветяване на кадхерин-17 в нормална тъкан. Cadherin-17 се експресира в епителни клетки на дебелото черво ( да се ) и тънките черва ( б ), но не и в стомашната лигавица ( ° С ), Черният дроб ( д ), белия дроб ( и ) или простатата ( F ).

Изображение в пълен размер

Таблица 2 показва резултатите от 17-кадхериново имунохистохимично оцветяване за 518 тумора от различни места в тялото. Мембранно оцветяване с кадхерин-17 присъства при 45 (96%) от 47 колоректални ракови заболявания; 38 (81%) от 47 показаха дифузно оцветяване (> 75%) (Фигура 3а). Кадхерин-17 също се изразява в 25 (56%) от 45 аденокарциноми на стомаха, 16 (57%) от 28 аденокарциноми на панкреаса и 9 (27%) от 33 холангиокарциноми (Фигури 3b-d). По-голямата част от аденокарциномите на стомаха, панкреаса и жлъчката (42 от 50, 84%) показват фокално или разпръснато оцветяване. Кадхерин-17 рядко се експресира в тумори от други места в тялото (Фигури 3д и е). От 331 изследвани тумора, кадхерин-17 се експресира само в 1 (0,3%), простатен аденокарцином.

Таблица в пълен размер

Имунохистохимично оцветяване на кадхерин-17 в туморната тъкан. Cadherin 17 се експресира в колоректален аденокарцином ( да се ), Стомашен аденокарцином ( б ), дуктален аденокарцином на панкреаса ( ° С ) и холангиокарцином ( д ), но не и при белодробен аденокарцином ( и ) или простатата ( F ).

Изображение в пълен размер

Таблица в пълен размер

Експресия на кадхерин-17 и цитокератин 7 в колоректален, стомашен и панкреатичен аденокарцином. ( да се, б ) Кадхерин-17 положителен колоректален аденокарцином ( да се ) и отрицателен за цитокератин 7 ( б ). ( ° С, д ) Кадхерин-17 положителен стомашен аденокарцином ( ° С ) и цитокератин 7 ( д ). ( и, F ) Кадхерин-17 положителен аденокарцином на панкреаса ( и ) и цитокератин 7 ( F ).

Изображение в пълен размер

Дискусия

Аденокарциномът на неизвестен първичен сайт е един от най-честите клинични проблеми. Седемте най-често срещани първични места са гърдите, дебелото черво, белите дробове, яйчниците, панкреаса, простатата и стомаха. 15 Тъй като метастатичните аденокарциноми от различни места могат да имат сходен микроскопски вид, идентифицирането на първичното място е трудно. Идентифицирани са няколко имунохистохимични маркера в помощ на хистологичната диагноза, включително цитокератин 7, цитокератин 20, транскрипционен фактор 1 на щитовидната жлеза, CDX2, специфичен за простатата антиген и мезотелин. 3, 4, 15 Въпреки това, все още липсва силно специфичен маркер за GI аденокарцином.

Кадхерин-17 е адхезивен протеин, който обикновено се експресира само в чревния епител. Тази изключително специфична локализация прави 17-кадхерин потенциален инструмент за имунохистохимична диагностика. Нашите резултати показват, че експресията на кадхерин-17 е много често срещана при колоректалните аденокарциноми и също се изразява в повече от половината аденокарциноми на стомаха и панкреаса и в малък брой холангиокарциноми. Експресията му не се ограничава до тумори с чревна метаплазия. Освен това, експресията на кадхерин-17 е много рядка при карциноми извън стомашно-чревния тракт. Тези наблюдения правят 17-кадхерин полезен маркер за хистологичната диагноза на аденокарцином на неизвестно първично място.

За допълнително разграничаване на колоректалните тумори от тези, получени от горната част на стомашно-чревния тракт, бяха използвани два подхода. Експресията на Cadherin-17 в колоректалния аденокарцином обикновено е дифузна и силна, докато експресията в аденокарциномите на горния стомашно-чревен тракт обикновено е фокусна или разпръсната. Другият подход, който използвахме, беше имунооцветяването за цитокератин 7. Имунореактивността на цитокератин 7 се наблюдава при аденокарциномите на повечето места в тялото, ограничавайки клиничното му приложение. Въпреки това, използването на кадхерин-17/цитокератин 7 с два маркера профилиране силно стесни кандидат-първичния сайт. В нашия набор от данни 37 от 38 (97,3%) кадхерин-17 (+)/цитокератин 7 (-) тумори са колоректални аденокарциноми. Другият беше стомашен аденокарцином. От 56, 49 (86,0%) кадхерин-17 (+)/цитокератин 7 (+) тумори са стомашни, панкреатични или жлъчни аденокарциноми, 6 са колоректални аденокарциноми и 1 е простатен аденокарцином. Следователно профилът на кадхерин-17/цитокератин 7 може да диференцира аденокарцином на горния и долния стомашно-чревен тракт с висока специфичност.

В нашия набор от тъкани кадхерин-17 се експресира в повече от 95% от колоректалните аденокарциноми. Един от двата имунонегативни случая на кадхерин-17 отговаря на критериите за минимално диференцирани карциноми на дебелото черво на големи клетки, 16 тумор, характеризиращ се със загуба на жлезиста диференциация и микросателитна нестабилност. Другият беше аденосквамозен карцином. Кадхерин-17 се експресира само при малко над половината аденокарциноми на стомаха и панкреаса и при 27% от холангиокарциномите. Тези резултати показват, че кадерин-17 (-) аденокарцином е малко вероятно да бъде колоректален аденокарцином, но не може напълно да се изключи възможността той да възникне от стомаха, панкреаса и жлъчните пътища.

Пробите от тъкани, използвани в нашия набор от тъкани, са получени от първични туморни места. Остава да се изясни дали 17-кадхеринът е запазил полезността си при метастатични тумори. При рак на стомаха, експресията на кадхерин-17 е значително по-честа в случаите на напреднал стадий 11, но при рак на панкреаса и колоректалната жлеза кадхерин-17 е по-честа при добре диференцирани тумори 10, 13 без лимфни метастази в лимфните възли. По-нататъшно тестване с биопсични проби от допълнителни метастатични ракови заболявания би било полезно.