диетата

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Диетата на ларвите влияе върху развитието на комарите, физиологията и разрешителността, когато Плазмодий
  • Ларвовата диета засяга микробиотата на ларвите и възрастните комари
  • Дискусия
  • Методи
  • Декларация за етика
  • Колония за комари и поддръжка
  • Хранене на личинки
  • Измервания на дължината на ларвите
  • Измерване на дължината на крилото
  • Анализ на микробиота и генна експресия
  • Инфекции от Плазмодий
  • Статистика
  • Допълнителна информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителни фигури и таблица 1
  • Коментари

Субекти

  • Инфекциозни заболявания
  • Микробиом
  • Немоделни организми

Обобщение

Въведение

Понастоящем приблизително половината от световното население е изложено на риск от заразяване с малария, причинена от инфекция с протозойните паразити от плазмодий 1. Човешката малария се предава чрез ухапвания от заразени женски комари Anopheles. Anopheles gambiae и A. coluzzii са основните вектори на маларията на Plasmodium falciparum в Африка, където 88% от смъртните случаи от малария са настъпили през 2015 г. 1. При поглъщане от женски комари в инфекциозно кръвно хранене, плазмодиевите паразити се подлагат на полово размножаване в лумена на средното черво, след това преминават през перитрофичната мембрана и епитела на средното черво и се диференцират в ооцисти при достигане на базалната ламина 2. През следващата една до две седмици ооцистите се подлагат на вътрешно митотично деление и узряване, докато се разкъсат, освобождавайки хиляди паразити, които мигрират към слюнчените жлези и могат да бъдат предадени на човешки гостоприемник чрез ухапване от комар.

Етапът на ооциста е критично пречка при развитието на паразити, определящо дали комарът ще убие паразита или ще предаде малария. Успехът на паразитната инфекция зависи от генетичните и негенетичните характеристики на всеки комар. Първо, размерът на комара влияе върху обема на погълнатата кръв, а оттам и на количеството поети паразити 3. Освен това, пътят на имунодефицит NF-KB (Imd) и пътят на тиоестер-протеин 1 (TEP1) допълват паразитите, когато преминат през епитела и влязат в контакт с кръвоносната система, съответно 2, 4, 5 6. И накрая, бактериалната общност на средното черво на комара пролиферира драстично в рамките на 24 часа след поглъщането на кръв и влияе отрицателно върху развитието на плазмодия чрез индуциране на имунни реакции и синтезиране на реактивни кислородни видове 6, 7, 8, 9. Съставът на микробиотата може също да повлияе и/или да се контролира от плазмодия, както се предполага от положителна корелация между дела на ентеробактериите с успешна инфекция с плазмодий 10 .

В лабораторен контекст предполагаме, че подобни ефекти от храненето на ларвите и околната среда могат да се превърнат в условия за отглеждане, и по-точно диета на ларви, засягаща биологията на ларвите и възрастните комари. Тъй като е известно, че диетата влияе върху състава на микробиотите в метазоани 23, 24, ние се интересувахме особено от оценката дали тя засяга микробиотата на колонизирани комари и следователно потенциално допринася за голямата разлика в състава на микробиотата между лаборатории 10, 25, 26, 27. В това проучване анализираме ефекта от диетата на ларвите върху развитието, микробиотата и конкуренцията на вектора A. coluzzii. Фокусирайки се върху три рибни диети, често използвани в насекомите, ние показваме, че тези диети диференцирано влияят върху скоростта на развитие на ларвите, размера на възрастните комари и микробиотата на ларвите и възрастните. Диетата на ларвите също влияе значително върху разпространението и интензивността на инфекцията с P. berghei, вероятно с механизъм, зависим от микробиота.

Резултати

Ларвената диета влияе върху развитието на комара, физиологията и разрешителността на плазмодия

( да се ) Дължини на ларвите на ден 7 на хранене с една от трите диети с ларви: рибни люспи Tetramin (FF), гранули от басейна на д-р Clarke (D) или гранули от риба Nishikoi (FP). ( б ) Средно време за какавидиране на ларвите, осигурено с всяка диета от първия ден на хранене. ( ° С ) Дължина на възрастните крила след хранене на ларвите в трите диети на ларвите. Данните показват, че означава ± sem от 3 независими експеримента и статистическите анализи са ANOVA след корекцията на предишния модел. *** стр

Изображение в пълен размер

Ларвовата диета засяга микробиотата на ларвите и възрастните комари

В заключение, нашите резултати дават нови прозрения за ефекта от диетата на ларвите върху развитието на комарите, микробиотата и разрешителността към паразитите от малария. Те също представляват технически интерес за отглеждането на комари, демонстрирайки, че може да се постигне по-бързо развитие при използване на гранулирани диети D и FP и че FP произвежда комари с по-висок процент на плазмодиева инфекция. .

Методи

Декларация за етика

Използването на животни е извършено в съответствие с Закона за животните в Обединеното кралство (Научни процедури) от 1986 г. Протоколът за заразяване на комари с P. berghei чрез хранене на кръв в заразени с паразити мишки е извършен съгласно издадения лиценз UK Office Office PPL70/7185 Януари 2010 г. Процедурите са леки до умерени по тежест и броят на използваните животни се свежда до минимум чрез включване на най-икономичните протоколи. Протоколите са приложени след одобрение от Комитета за преглед на етиката на Императорския колеж.

Колония за комари и поддръжка

Проведена е експериментална работа в колонията An. Coluzzii Ngousso, създадена през 2006 г. от комари, събрани в полето на Камерун, държани в човешка кръв при 27 ° C и влажност 70%, с 12 h: 12 h светлинен цикъл/тъмнина. Възрастните комари са хранени с 5% разтвор на фруктоза и ларвите са държани в дестилирана вода. Поколения ларви преди тези, получени за диетични лечения, бяха хранени с Tetra FF смлени на 1-2 mm фрагменти, контролната диета, използвана в това проучване. Какавидите се събират ежедневно, поставят се в стъклени чаши с дестилирана вода и се прехвърлят в клетки.

Хранене на личинки

За всяко диетично лечение, 400 (± 10%) 48-годишна възраст без хранене Ан. Ларвите на coluzzii за първи етап се преброяват ръчно или с помощта на сортер за ларви COPAS (Union Biometrica, САЩ) и се поставят в пластмасова тава. Всяка тава с ларви е хранена с една от трите конвенционални диети на основата на риба: Tetra Tetramin Fish Flakes („FF“), Pool Pellets на д-р Clarke („D“) и рибни пелети Nishikoi („FP“). Хранителните обобщения на тези диети са показани в таблица 2. Както е съобщено в таблица 2, диетите се доставят в количества, които осигуряват сравними нива на хранителни съставки във всяка храна. FFs бяха леко смесени, за да се намали размерът на люспите, както обикновено се прави в нашата лаборатория за отглеждане на ларви.

Таблица в пълен размер

Измервания на дължината на ларвите

Деветдневни ларви (от момента на събиране на яйца) бяха събрани от всяко третиране от 3 независими експеримента и поставени в отделни ямки на 96-ямкова плака за изобразяване при 20-кратно увеличение. Общата дължина на тялото беше измерена от върха на главата до върха на корема с Фиджи 41 .

Измерване на дължината на крилото

Двадесет възрастни от всяко лечение са събрани от 4 независими експеримента. Едно крило беше отстранено от всеки индивид и залепено върху лист хартия. След сканиране на хартията дължините на крилата бяха измерени с Фиджи 41 .

Анализ на микробиота и генна експресия

Двадесет индивида (9-дневни ларви, женски 3-5 дни преди или 24 часа след хранене с кръв) бяха събрани от всяко третиране от 4 независими експеримента, суспендирани в 70% етанол за 3 до 5 минути, след това измити 3 пъти в PBS както преди 25. Червата и яйчниците на възрастни бяха дисектирани и взети проби в 2 групи от 10 тъкани. Форцепсът и предметните стъкла се почистват с дестилирана вода и етанол между всяка проба. За количествено определяне на бактериите в храната, дневно количество (d7 +) храна се хомогенизира в 5 ml стерилна вода, след това се вземат проби от 1 ml, центрофугират се при 800 g в продължение на 5 минути и супернатантата се изхвърля. За всяка диета се наблюдават 4 повторения. За да се нормализира количеството на РНК, суспензия от Sf9 клетки от сливна култура от 175 cm2 колба беше разделена на 12 проби.

РНК се екстрахира от цели ларви, възрастни тъкани и гранулирано водно съдържание с тризол и хлороформ, утаява се с изопропанол и се промива два пъти в 70% етанол. Обратната транскрипция (Takara) се извършва, като се използва PrimeScript RT Enzyme Mix I с 650 ng РНК, следвайки инструкциите на производителя. Бактериалният 16S рРНК ген е използван за количествено определяне чрез qRT-PCR, извършен върху LightCycler 480 (Roche), като се използва SYBR Premix Ex Taq комплект (Takara), следвайки инструкциите на производителя. Бактериалното натоварване и съставът се оценяват, като се използват общи 16S rRNA генни праймери за всички бактерии и специфични за бактериални семейства, за които е известно, че колонизират комари в насекомите, съответно (Таблица S1 и справка 25). Бактериалното натоварване и експресията на вителогенин са представени като съотношения на целевия ген към рибозомния протеин на гена S7 (S7) 40S Anopheles, докато бактериалното натоварване в храната е количествено определено като съотношение на GAPDH (глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа) домакински ген в Sf9 клетки.

Плазмодиеви инфекции

8-12 седмична женска CD1 мишка се инжектира интраперитонеално със 100 ul заразена с P. berghei 5O7 кръв и се задържа в продължение на два дни, за да позволи растежа на паразитите и диференциацията на гаметоцитите. След като провери дали паразитемията е между 3 и 8%, на мишката се инжектира интрамускулно с 4 uL. g -1 разтвор за анестезия (Rompun 0,33%, кетамин 33 mg mL -1 в PBS) и се използва за хранене на три чаши комари с кръв на смени от 5-10 минути. Комарите са държани 12 дни при 20 ° C, за да позволят развитието на паразита до стадия на ооцистата. След това мъртвите комари бяха отстранени и отбелязани и всички оцелели комари бяха дисектирани за броя на ооцистите с помощта на флуоресцентен микроскоп. За всеки експеримент на поне 50 комара на състояние е предложено кръвно хранене, а незасетите комари са убити 24 часа по-късно. Средно се преброяват ооцистите на 36 (± 3,6 sem) комара за състояние на експеримент. Разликите в средната интензивност и разпространение са посочени в текста като средни стойности на ефекта на всяка реплика; т.е. (данни (тестова диета) - данни (контролна диета))/данни (контролна диета).

Статистика

Статистическите анализи бяха извършени с използване на обобщени линейни смесени модели (GLMM) в R (версия 3.2.3). Извършен е ANOVA тест х 2 в логистична регресия (glmer) с факториални данни (разпространение, оцеляване). Извършен е тест на Wald Z върху нулева надута отрицателна биномиална регресия (glmmADMB) за броя на ооцистите. Извършен е ANOVA тест х 2 в обща линейна регресия (lmer) върху qPCR данни (16S, генна експресия), дължина на ларвата, време на какавидация и дължина на крилото. GLMM анализите разлагат данните на фиксиран компонент (тук ларвни диети) и случаен компонент (тук те възпроизвеждат експерименти). Представените на фиг. 2 коефициенти са експоненциални на регресионните коефициенти. Размерът на пробата е избран според стандартните протоколи (брой на ооцистите, генна експресия, анализ на микробиота) или е оценен според опита на отглеждане на комари (развитие на ларви). Комарите са изключени, ако не са се хранили с кръв, ако са се спукали по време на дисекция (анализ на микробиота, експресия на гени) или ако са умрели (като ларви или възрастни) по време на експеримента.

Допълнителна информация

Кодове за достъп: Номерата за присъединяване към Vectorbase (www.vectorbase.org) на гените, споменати в това проучване, са: AgS7 - AGAP010592; Вителогенин - AGAP004203.

Как да цитирам тази статия: Linenberg, I. et al. Диетата на ларвите влияе върху развитието на комари и разрешителността на плазмодиевата инфекция. Sci. Rep. 6, 38230; doi: 10.1038/srep38230 (2016).

Бележка на редактора: Springer Nature остава неутрален по отношение на юрисдикционни претенции за публикувани карти и институционални принадлежности.

Допълнителна информация

PDF файлове

Допълнителни фигури и таблица 1

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки. Ако откриете нещо злоупотребяващо или което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, маркирайте го като неподходящо.