сфинголипидни

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • ACS Faa1 и Faa4 участват в усвояването на LCB
  • Намаляването на абсорбцията на LCB в faa1 клетки Δ faa4 Δ не се причинява от увеличен изход на LCB или променен липиден състав
  • Вносът на LCFA и LCB е конкурентен
  • Абсорбциите на LCFA и LCB се различават по своите енергийни нужди
  • ACSL за бозайници участват в усвояването на LCB
  • Дискусия
  • Методи
  • Щамове на дрожди и среда
  • Клетъчна култура
  • Плазмиди
  • Тест за усвояване на липиди
  • DHS тест за освобождаване
  • [3Н] DHS тест за маркиране
  • Имуноблот
  • Инвитро ACS анализ
  • Допълнителна информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

Субекти

Обобщение

Въведение

Клетките абсорбират различни извънклетъчни вещества през плазмената мембрана и ги използват като източници на енергия или предшественици на биомолекули. Тъй като хидрофобната бариера, образувана от липидни бислои, не позволява транспортирането на хидрофилни материали, клетките трябва да ги внасят чрез специфични транспортери. Все още не се стига до заключение дали хидрофобните материали, като мастни киселини (FA), навлизат в клетките при физиологични условия чрез пасивна дифузия или чрез транспортери.

Досега транспортните дейности на FA на членовете на семейство ACS не са експериментално проверени с помощта на пречистени протеини поради технически трудности, присъщи на такива in vitro анализи, което води до дебати дали ACS функционира само при активиране на FA или и двете при активиране на FA и при транспортирането на FA 5, 8. В първия случай ACS би причинил видимо увеличаване на усвояването на LCFA чрез улавяне на LCFA като ацил-CoA, така че те да не се дифузират в извънклетъчните пространства или чрез намаляване на вътреклетъчната концентрация на LCFA. В последния случай транспортът и активирането на LCFA от ACS ще бъдат свързани, процес, наречен вектор ацилация.

Сфинголипидите са един от основните липидни компоненти на еукариотните мембрани и имат широк спектър от физиологични функции, включително клетъчна адхезия, образуване на бариера за пропускливост на кожата, поддържане на миелин, имунитет, сперматогенеза и метаболизъм на глюкозата 9, 10, 11, 12, 13, 14 15. Церамидът, хидрофобният скелет на сфинголипидите, е изграден от FA и дълговерижна основа (LCB). Най-разпространената LCB при бозайниците е сфингозинът (SPH), който съдържа транс двойна връзка между позиции C4 и C5 (фиг. 1а). SPH и наситеният дихидросфингозин LCB (DHS) съществуват навсякъде сред тъканите на бозайници. Дрождите нямат SPH, но съдържат DHS и фитосфингозин (PHS), който има хидроксилна група в позицията C4 16 (фиг. 1а). При бозайниците PHS съществува в специфични тъкани, като кожата, тънките черва и бъбреците 9 .

Изображение в пълен размер

Не всички липиди могат да бъдат транспортирани в клетки: по-скоро само няколко класа липиди, включително LCFA, LCB и моноацилглицероли, могат да го направят ефективно. Ефективността на абсорбция на други класове липиди, като сложни сфинголипиди, керамиди, S1P, триацилглицерол и глицерофосфолипиди, е ниска. Въпреки че естествените керамиди и глицерофосфолипиди с LCFA почти не се внасят в клетките такива, каквито са, скъсяването на FA частта им позволява (т.е. изкуствени късоверижни керамиди и глицерофосфолипиди) да влязат. Освен това ефективността на транспортиране на наситени LCFAs, като палмитинова киселина и стеаринова киселина, е висока, докато тези на наситените VLCFAs, като арахидова киселина и бехенова киселина, са ниски. Следователно можем да заключим, че липидите, които могат ефективно да влязат в клетките, споделят обща структура: дълговерижен хидрофобен гръбнак и малка група от полярни глави.

Предполагаме, че структурният фактор, ограничаващ транспорта на определени липиди до клетките, е специфичността на субстрата на един или повече често срещани транспортери. Поради това изследвахме участието на ACS в усвояването на LCB, използвайки генетично проследими дрожди. Установихме, че поглъщането на LCB е значително намалено при мутант с двойно делеция на ACS (faa1Δfaa4Δ). Освен това превозите LCFA и LCB бяха взаимно конкурентни. Тези резултати предполагат, че Faa1 и Faa4 действат като транспортиращи както за LCFA, така и за LCB. Трудността при разграничаването на транспорта на LCFA от метаболитната активност (добавяне на CoA) създаде дългогодишния дебат за ролята на ACS в усвояването на LCFA, както е описано по-горе. Този дебат обаче не се отнася за LCB: те не притежават карбоксилна група, акцептор на CoA, така че катализираният от ACS етап на активиране не може да се осъществи в LCB. Нашите резултати ясно разграничават транспортните и ACS дейности за LCB и показват, че ACS имат транспортна функция. Освен това открихме, че членовете на семейство ACSL, хомолозите на бозайниците на ACS Faa1 и Faa4, участват в транспорта на LCB при бозайници.

Резултати

ACS Faa1 и Faa4 участват в усвояването на LCB

Първо изследвахме времевия ход на усвояването на [3 H] DHS и го сравнихме с този на [3 H] палмитинова киселина. Вносът на DHS беше бърз и започна да се стабилизира около 5 минути (фиг. 1б). Транспортът на палмитинова киселина е по-бавен от DHS и се увеличава линейно до 30 минути (фиг. 1в). Имайки предвид тези резултати, ние определяме 5 минути и 30 минути като съответните инкубационни периоди за тестовете за усвояване на [3 H] DHS и [3 H] палмитинова киселина в следващите анализи. След това изследваме скоростта на усвояване на [3 H] DHS при различни концентрации. Скоростта на поглъщане се увеличава почти линейно до 40 μM (фиг. 1г).

25% от тези от клетки от див тип, количество, което корелира добре с това, получено от анализа на усвояването на липидите (фиг. 1д). По този начин транспортът на DHS е намален във faa1Δfaa4Δ клетки и е проверена полезността на анализа за усвояване на липидите.

След това изследвахме участието на Faa1 и Faa4 в транспорта на две други LCB, PHS и SPH, до клетки. DHS и PHS са естествени LCB в дрождите. От друга страна, SPH, който е основният LCB при бозайниците, не съществува в дрождите, но може да бъде внесен и метаболизиран, ако е добавен екзогенно 26, 28, 29. Установихме, че не само поглъщането на DHS, но също така SPH и PHS са намалени в faa1Δfaa4Δ клетки (фиг. 1g). Тези резултати показват, че Faa1 и Faa4 участват в усвояването на всички видове LCB, изследвани.

Ако Faa1 и Faa4 функционират в приемането на LCB като липидни транспортери, те трябва да бъдат локализирани в плазмената мембрана. За да проверим тази хипотеза, ние изследвахме местоположението на Faa1 и Faa4 хромозомно слети с GFP чрез микроскопско наблюдение. Установихме, че Faa1-GFP се намира главно в плазмената мембрана (фиг. 1h). Faa4-GFP също е локализиран в плазмената мембрана, но само частично; по-голямата част е била разположена във вътрешни органели. Частичната локализация на Faa4 в плазмената мембрана е в съответствие със слабата транспортна активност на Faa4 (фиг. 1д).

Намаляването на усвояването на LCB в клетки faa1Δfaa4Δ не е причинено от увеличен изход на LCB или променен липиден състав

На теория е възможно очевидното намаляване на поглъщането на LCB в клетки faa1Δfaa4Δ да е причинено от повишен излив. Следователно, за да изключим тази възможност, извършихме LCB анализ за освобождаване, използвайки [3 H] DHS. След зареждане на клетките с [3 H] DHS за 1 час, се измерват количествата на [3 H] DHS, освободени през следващите 10 минути. Клетки от див тип освобождават 13% от предварително заредения DHS (фиг. 2а). Количеството освободен DHS е малко по-високо в faa1Δfaa4Δ клетки (15% предварително зареден DHS [3 H]). Това леко увеличение обаче не може да обясни голямото намаляване на поглъщането на DHS, наблюдавано във faa1Δfaa4Δ клетки (Фиг. 1д). По-скоро разликата в количествата DHS, освободени между клетки от див тип и faa1Δfaa4Δ, може да е била причинена от разликите в техните дейности по внос, тъй като част от освободените DHS отново са влезли в клетките по време на инкубационния период.

Вносът на LCFA и LCB е конкурентен

Нашите открития показват, че Faa1 и Faa4 участват както в усвояването на LCFA, така и в LCB. При субстратна конкуренция два (или повече) субстрата за един и същ ензим се конкурират помежду си и се метаболизират с различни скорости в зависимост от концентрацията и афинитета на ензима. Ако Faa1 и Faa4 действат като транспортери и за LCFA, и за LCB, LCB трябва конкурентно да инхибира транспорта на LCFA и обратно. Когато беше извършен анализ на [3 H] DHS поглъщане в присъствието на палмитинова киселина, внесеният DHS беше намален по дозозависим начин на палмитинова киселина (Фиг. 3а). Добавянето на палмитинова киселина в концентрации, равни и 4 пъти по-високи от тези на DHS, е причинило съответно намаляване на внесения [3 H] DHS с 85% и 92% (в сравнение с внесените нива при липса на палмитинова киселина).

След това изследвахме конкурентното инхибиране на приемането на DHS от други FA. Палмитиновата киселина и арахидоновата киселина (C20: 4) инхибират поемането на DHS (фиг. 3в). Арахидовата киселина (C20: 0) също ограничава абсорбцията, макар и слабо. От друга страна, лауриновата киселина (С12: 0), палмитолеиновата киселина (С16: 1) и 2-хидроксипалмитиновата киселина нямат ефект. Следователно броят на видовете FA, които конкурентно пречат на транспорта на DHS, е ограничен.

Абсорбциите на LCFA и LCB се различават по своите енергийни нужди

За да получим информация за енергийните нужди за абсорбция на LCB, извършихме LCB тест за абсорбция в присъствието на натриев азид и 2-дезокси-D-глюкоза, които изчерпват клетъчния АТФ. Лечението с натриев азид/2-дезокси-D-глюкоза инхибира приемането на палмитинова киселина до 44% от нивата, наблюдавани в нетретираните клетки (фиг. 4а). От друга страна, същото лечение няма ефект върху транспорта на DHS до клетките (Фиг. 4b). Тези резултати показват, че ATP е необходим за транспортиране на LCFA, но не и за внос на DHS. Следователно, въпреки че LCFA и DHS изглежда се транспортират до клетки чрез едни и същи транспортери, техните енергийни изисквания са различни.

След това изследваме ефектите от тези мутации върху усвояването на DHS. Количеството DHS, транспортирано в клетки, експресиращи Faa1 D538A, е почти идентично с това на клетките, приютяващи вектора (фиг. 4g), което показва, че Faa1 D538A няма почти никаква DHS транспортна активност. Следователно, ACS активността на Faa1 D538A е добре корелирана както с неговата палмитинова киселина, така и с DHS транспортните дейности. От друга страна, транспортната активност на DHS на Faa1 S271A не корелира с неговата ACS активност. Въпреки че Faa1 S271A има само остатъчна ACS активност (фиг. 4д), неговата DHS транспортна активност е еквивалентна на тази на див тип протеин Faa1 (фиг. 4ж). Тъй като Ser271 е добре запазен остатък в мотива на ATP-AMP, вероятно е от съществено значение за използването на ATP. Заедно с резултата, получен от лечението с натриев азид/2-дезокси-D-глюкоза (фиг. 4а, б), тези резултати показват, че транспортирането на DHS и палмитиновата киселина са различни по отношение на тяхното използване на АТФ (или липсата им от тях).

ACSL за бозайници участват в усвояването на LCB

Сега разширяваме дискусията си за усвояването на LCB от дрожди върху бозайници. Първо изследвахме времевия ход на абсорбция на [3 H] DHS и [3 H] палмитинова киселина, използвайки IEC-6 тънкочревни епителни клетки. И вносът на [3 H] DHS и [3 H] палмитинова киселина постепенно започва да се стабилизира около 10 минути (фиг. 5а, б). След това изследвахме конкурентната абсорбция на палмитинова киселина спрямо DHS. Вносът на [3 H] палмитинова киселина е инхибиран от DHS и обратно (фиг. 5в, г), което предполага съществуването на общи транспортери за LCFA и LCB при бозайници, като дрожди.

След това изследвахме участието на ACSL в поглъщането на DHS, използвайки клетки IEC-6 и ACSL инхибитора триаксин С. Лечението с триаксин С предизвика намален транспорт както на [3 H] палмитинова киселина, така и на [3 H] DHS (фиг. 5g, h). Тези резултати показват, че ACSL на бозайниците ACSL и ACSVL4 също участват в усвояването на LCB, по подобен начин на техните колеги от дрожди.

Дискусия

В обобщение тук разкрихме, че ACS (Faa1 и Faa4 в дрождите и ACSL1, ACSL4, ACSL5, ACSL6 и ACSVL4 при бозайници) участват в усвояването на LCB. Освен това предоставихме важна информация за молекулярния механизъм на транспорта на LCFA. Нашите открития силно подкрепят хипотезата, че ACS притежават транспортна активност, въпреки че това трябва да бъде допълнително проверено с in vitro анализи, използващи пречистени протеини. LCB показват голямо обещание като полезни инструменти за анализи на транспортната функция (и) на ACS.

Методи

Щамове на дрожди и среда

Клетъчна култура

Епителни клетки на тънките черва на плъхове (IEC-6 клетъчна линия 47) се осигуряват от RIKEN BRC и се отглеждат в модифицираната среда на Dulbecco Eagle (DMEM; Sigma, Сейнт Луис, САЩ), съдържаща 10% FCS и допълнена със 100 U/ml пеницилин, 100 μg/ml стрептомицин (Sigma) и 4 μg/ml инсулин (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония). Triacsin C е закупен от Alomone Labs (Йерусалим, Израел).

Плазмиди

Тест за усвояване на липиди

Анализът за усвояване на липиди с използване на IEC-6 клетки, отгледани върху ямки с 12 ямки, се извършва, както е описано по-долу. Културната среда беше променена на 0,5 ml DMEM без FCS, но съдържаща 4 μg/ml инсулин. След един час инкубация при 37 ° С, клетките бяха третирани с 6 μl липиден разтвор (0,1 μCi и крайна концентрация 5 μM) при 37 ° C за подходящи периоди от време. Клетките се охлаждат върху лед и средата се отстранява. Клетките се промиват с 0,5 ml студен PBS, съдържащ 1 mg/ml FA без BSA, суспендират се в 0,5 ml от същия разтвор, отстраняват се от съдове с помощта на скрепери, прехвърлят се в пластмасови епруветки и се утаяват чрез центрофугиране (750 g, 4 ° С, 3 минути). Липидите се екстрахират чрез суспендиране на клетки в 120 μl хлороформ/метанол (2: 1, v/v). Радиоактивността, свързана със средна и клетъчна фракция, беше измерена с помощта на течен сцинтилационен брояч LSC-3600. Транспортната активност се изчислява като радиоактивност в клетъчната фракция на обща радиоактивност и се изразява като процент.

DHS тест за освобождаване

Дрождните клетки са белязани с [3Н] DHS (0.1 uCi, 3.3 nM) при 30 ° С за 5 минути. След това клетките бяха охладени върху лед, измити със студена YPD среда, съдържаща 1 mg/ml BSA два пъти, и суспендирани в студена YPD среда, съдържаща 1 mg/ml BSA. Клетките с еднакво количество радиоактивност се инкубират при 30 ° С в продължение на 10 минути. След това клетките (фракция А) се охлаждат върху лед и се отделят от средата (фракция В) чрез центрофугиране. Радиоактивността във фракции А и В беше измерена с помощта на течен сцинтилационен брояч LSC-3600. Процентът на освободените DHS за всяка проба се изчислява като (радиоактивност във фракция В)/[обща радиоактивност (радиоактивност във фракции А + В)] × 100.

[3Н] DHS тест за маркиране

[3Н] DHS тест за маркиране се извършва, както е описано по-горе 26, 49 .

Имуноблот

Имуноблотинг беше извършен, както е описано по-рано 50, използвайки анти-DYKDDDDK (FLAG) (0,5 μg/ml; Wako Pure Chemical Industries), анти-FLAG M2 (1 μg/ml; Agilent Technologies), анти-AID (разреждане 1: 1000; BioROIS, Токио, Япония) или анти-Pgk1 антитяло (1 μg/ml; Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) като първични антитела и HRP-конюгиран анти-миши или заешки IgG F (ab ') 2 фрагмент ( всяко разреждане 1: 7500; GE Healthcare Life Sciences, Бъкингамшир, Великобритания) като вторични антитела. Откриването се извършва с помощта на Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific) или Western Lightning Plus-ECL (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, USA).

In vitro ACS анализ

Общите мембранни фракции се приготвят, както е описано по-рано 40. Общите мембранни фракции (0,2 μg) се инкубират с 10 μM [3 H] палмитинова киселина при 37 ° C в продължение на 2 минути в 100 μl ACS буфер [200 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 mM ATP, 8 mM MgCl 2, 2 mM EDTA, 20 mM NaF, 0,1% Triton X-100 и 0,5 mM CoA]. Реакцията се прекратява чрез добавяне на 500 μl изопропанол/н-хептан/1 MH2S04 (40: 10: 1, v/v). За да се отстрани нереагиралата [3Н] палмитинова киселина, екстракцията с n-хептан се извършва три пъти. Във всеки етап към пробите се добавят 500 μl n-хептан, след което органичната фаза (съдържаща [3Н] палмитинова киселина) се отделя от водната фаза (съдържаща реакционния продукт [3Н] палмитоил-КоА) чрез центрофугиране (17 000 g, 4 ° С, 5 минути). И накрая, радиоактивността, свързана с получената водна фаза, беше измерена с помощта на течен сцинтилационен брояч LSC-3600.

Допълнителна информация

Как да цитирам тази статия: Narita, T. et al. Дълговерижните основи на сфинголипидите се транспортират в клетките чрез ацил-КоА синтетазите. Sci. Rep. 6, 25469; doi: 10.1038/srep25469 (2016).

Допълнителна информация

PDF файлове

Допълнителна информация

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки. Ако откриете нещо злоупотребяващо или което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, маркирайте го като неподходящо.