надбазалния

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Влияние на супрабазално инактивиране на фактор AP1 върху епидермалната морфология
  • Надбазалната експресия на TAM67 увеличава пролиферацията на кератиноцитите на базалния слой
  • Надбазалната експресия на TAM67 блокира образуването на тумор
  • TAM67 спрямо TPA: подобен фенотип
  • Дискусия
  • AP1 фактори: ключова роля в нормалния епидермис
  • Влияние на супрабазално инактивиране на активност на фактор AP1
  • материали и методи
  • TAM67 трансгенни мишки
  • Проучвания за канцерогенност
  • Антитела и имунологични методи.
  • Терминологичен речник

Субекти

  • Рак
  • Клетъчно разпространение
  • Онкогенеза

Обобщение

Въведение

Ние предположихме, че AP1 факторите изпълняват различни функции в базалния (пролиферативен) срещу супрабазалния (диференциращ) епидермис (Eckert et al., 2004). Тестването на тази хипотеза обаче се усложнява от факта, че практически всички членове на семейство AP1 са изразени, на някакво ниво, в базалното и надбазалното отделение (Welter and Eckert, 1995; Angel et al., 2001; Mehic et al. Al. ., 2005). В опит да разберат ролята на AP1 факторите в епидермалната канцерогенеза, Colburn и неговите колеги са използвали промотора K14, за да насочат експресията на TAM67 към основния слой на кератиноцитите (Young et al., 1999). TAM67 е доминираща отрицателна форма на c-jun, която взаимодейства екстензивно с всички AP1 фактори, за да инхибира трансактивацията (Brown et al., 1994). В тези интересни проучвания инактивирането на фактор AP1 в базалния слой не води до очевидни промени в пролиферацията на кератиноцити или външния вид на епидермиса или кожата; обаче мишките са по-малко податливи на прогресия на рака (Young et al., 1999; Thompson et al., 2002; Cooper et al., 2003).

Важна цел на настоящото проучване беше да се оцени ролята на AP1 факторите в супрабазалния епидермис. За да постигнем това, генерирахме мишки, при които TAM67 се експресира в надбазалните епидермални слоеве. Използваме индуцируема система, която позволява обратимо да активира експресията на TAM67 в надбазалния епидермис чрез прилагане на доксициклин (Dox) в питейна вода. Нашите експерименти показват, че супрабазалната експресия на TAM67 води до удебелен, хиперпролиферативен паракератотичен епидермис, но въпреки тази обширна хиперпролиферация епидермисът е устойчив на DMBA/TPA-зависимо туморно образуване.

Резултати

Влияние на супрабазално инактивиране на фактор AP1 върху епидермалната морфология

Изображение в пълен размер

Надбазалната експресия на TAM67 увеличава пролиферацията на кератиноцитите на базалния слой

Увеличението на дебелината на епидермиса може да се дължи на по-голямо оцеляване на клетките в супрабазалните слоеве, по-голяма адхезивност на клетките в стратифицираните слоеве или по-голяма пролиферация на базалните клетки. Първо тествахме дали супрабазалното инактивиране на фактор AP1 влияе върху пролиферацията на базалните кератиноцити. За да тестваме това, ние наблюдаваме включването на BrdU и нивото Ki67. Мишки, експресиращи TAM67, бяха третирани с BrdU в продължение на 2 часа и бяха подготвени тъканни срезове за откриване на BrdU и Ki67. Както е показано на Фигура 2а, броят на BrdU и Ki67 положителни ядра е пет пъти по-висок в TAM67 (+ Dox) положителен епидермис, което предполага, че увеличената пролиферация на базалния и надбазалния слой допринася за фенотипа.

Изображение в пълен размер

За по-нататъшно оценяване на въздействието на супрабазалната експресия на TAM67 върху клетъчната пролиферация и диференциация, ние наблюдавахме експресията на маркери за епидермална диференциация. Кератин К1, инволюкрин, филагрин и лорикрин обикновено се експресират в диференцирани супрабазални кератиноцити (Eckert et al., 1997). В TAM67-позитивния епидермис К1, инволукрин и филагрин показват нормална супрабазална експресия, което предполага, че кератиноцитите продължават да се подлагат на диференциация (Фигура 2b). Лорикринът, който обикновено присъства като дискретна лента в горния епидермис, се открива дифузно в множество супрабазални слоеве в TAM67-положителния епидермис (Фигура 2b). Освен това отсъствието на супрабазалната функция на фактор AP1 е свързано с намалени нива на инволукрин и лорикрин (Фигура 2в); което предполага, че супрабазалната функция на фактор AP1 е необходима за поддържане на експресията на тези гени.

Кератините К5 и К14 обикновено се експресират в базални кератиноцити; обаче при TAM67 положителни мишки се наблюдава експресия както в базалния, така и в надбазалния слой. Наличието на тези протеини в надбазалния епидермис е в съответствие с идеята, че клетките се забавят в диференциацията. Освен това открихме експресия на високо ниво на кератин К6, кератин, който не присъства в нормалния епидермис, но се открива в хиперпролиферативния епидермис (Sun et al., 1983).

Надбазалната експресия на TAM67 блокира образуването на тумор

TAM67-експресираща туморна формация в надбазалния епидермис. ( да се ) Намаляване на образуването на тумор при мишки, експресиращи супрабазален TAM67. TAM67-rTA мишки бяха третирани със или без еднократно локално приложение на 100 ug DMBA, последвано 1 седмица по-късно чрез третиране със или без Dox и TPA в продължение на 22 седмици, както е описано в Материали и методи. Мишките се наблюдават ежеседмично за поява, брой и размер на тумора. Всяка обработена група включваше десет животни. Стойностите са средни ± sem. На 10-21 седмица имаше значително повече тумори в групата с DMBA + TPA в сравнение с DMBA + TPA (+ Dox), P 2)/2. Показани са само групите, лекувани с DMBA/TPA (± Dox). Всяка обработена група включва десет животни и стойностите са средни ± sem Размерът на тумора на 13-18 седмици е значително по-голям в групата DMBA/TPA в сравнение с групата DMBA + TPA (+ Dox), P

Отговор на остро лечение на ТРА. ( да се ) Субабазалният TAM67 положителен епидермис прилича на кожа, третирана с TPA. Мишките TAM67-rTA се държат в питейна вода със или без Dox в продължение на 12 дни, последвано от локално приложение на TPA, както е посочено. След 24 часа лечение с ТРА, тъканта се събира и разделя за H&E оцветяване или инкубация с посоченото антитяло. Флуоресцентните изображения са 1 μm конфокални оптични секции. ( б ) Острото лечение с TPA увеличава пролиферацията в TAM67-позитивния епидермис. Мишките TAM67-rTA бяха държани на Dox на диета в продължение на 12 дни. След това епидермисът беше изложен с 10 μg TPA/100 μl ацетон и тъканта бе събрана 24 часа по-късно, за да бъде оцветена с Ki67.

Изображение в пълен размер

След това изследваме дали хиперпролиферацията, наблюдавана в епидермиса, се открива и в роговицата. Както е показано на Фигура 5а, TAM67-FLAG се експресира при сравними нива както в епидермиса, така и в роговичния епител. Въпреки това, за разлика от епидермиса, експресията на TAM67 в епител на роговицата не причинява хиперпролиферация (Фигура 5b), което предполага, че TAM67-зависимата хиперпролиферация се наблюдава само в избрани епителии.

Липса на отговор в епител на роговицата. ( да се, б ) Експресия на високо ниво на TAM67-FLAG в епител на роговица на мишка. TAM67-rTA мишки бяха третирани със или без Dox в продължение на 12 дни и епидермалният и роговичен епител бяха събрани, за да се анализира нивото на TAM67-FLAG и да се подготвят хистологични срези. Резултатите от имуноблот се нормализират въз основа на откриването на β-актин (не е показано).

Изображение в пълен размер

Дискусия

AP1 фактори: ключова роля в нормалния епидермис

Мрежата на фактора за транскрипция AP1 включва членове jun (c-jun, junB, junD) и fos (c-fos, FosB, Fra-1, Fra-2). Те образуват jun-jun и jun-fos хомодимери и хетеродимери, които взаимодействат с консенсусни места за свързване на ДНК на целевите гени, за да регулират генната експресия. AP1 факторите са ключови интегратори на трансдукция на сигнала в епидермиса, които посредничат навлизането на цитокини, растежни фактори, диференциращи агенти и стимулатори на растежа. Тези сигнали преминават през митоген-активираната протеинкиназна каскада, което води до нарушена функция на фактор AP1. Факторите AP1 контролират пролиферацията на кератиноцитите (Takahashi et al., 2002; Shi and Isseroff, 2005; Mizuno et al., 2006), диференциацията (Eckert et al., 2003, 2004; Adhikary et al., 2004) и апоптозата (Efimova et al., 2004; Raj et al., 2006) и са важни за прогресията на тумора и развитието на псориазис (Kahn et al., 1993; Saez et al., 1995; Rutberg et al. al., 2000; Eckert et al., 2002, 2003, 2004; Efimova et al., 2002, 2003, 2004; She et al., 2002; Iizuka et al., 2004).

Влияние на супрабазално инактивиране на активност на фактор AP1

В настоящото изследване ние изследваме въздействието на супрабазалното инактивиране на фактор AP1 върху диференциацията и пролиферацията на кератиноцити. Избрахме за модел, насочвайки доминантно-отрицателния израз c-jun (TAM67) към надбазалния епидермис. Този подход има няколко предимства. Първо, TAM67 пречи на функцията на всички AP1 транскрипционни фактори (Brown et al., 1994). Второ, използването на промотора на инволюкрин позволява TAM67 да бъде насочен към надбазалния епидермис и облекчава проблемите, наблюдавани при нокаутиращи мишки, при които протеинът се губи от всички слоеве. Трето, вече има модел, насочен към базалния слой TAM67 (Young et al., 1999, 2002; Thompson et al., 2002; Cooper et al., 2003; Matthews et al., 2007), който позволява сравнение на въздействието на изходно ниво спрямо супрабазално инактивиране на фактор AP1.

В съответствие със забавена диференциация, К5 и К14 кератините, които обикновено се експресират изключително в базалния слой, се откриват във всички епидермални слоеве. Това предполага, че събитията, необходими за инактивиране на експресията на K5 и K14, са компрометирани. Освен това, K6 се експресира във всички епидермални слоеве. К6 е кератин, който се експресира при хиперпролиферативни условия, но не се експресира в нормален епидермис. K6 се експресира в псориазис, третиран с естер на естер на форбол и други състояния, свързани с хиперпролиферация на кератиноцити (Sun et al., 1984; Heyden et al., 1994a, 1994b; Iizuka et al., 2004). По този начин, супрабазалната експресия на TAM67 води до повишена пролиферация на базалния слой и забавена диференциация и в крайна сметка води до обширна хиперкератоза.

Поради хиперпролиферативния фенотип, предполагаме, че супрабазалните мишки TAM67 биха били податливи на образуване на тумор. Не са се образували тумори при третирани с DMBA TAM67 положителни или отрицателни мишки; лечението с DMBA/TPA обаче води до образуване на тумор. Изненада беше да се установи, че DMBA/TPA-зависимото образуване на тумор е значително намалено при супрабазални мишки TAM67. Това предполага, че въпреки че TAM67 води до повишена епидермална пролиферация, това не води до повишено образуване на тумор. Ние разглеждаме възможността TAM67 да повлияе на активността на TPA за насърчаване на разпространението в протокола за канцерогенеза. Нашите експерименти обаче показват, че епидермисът, експресиращ TAM67, е напълно компетентен да реагира на TPA. TAM67-позитивният епидермис има пет пъти повече Ki67-положителни базални клетки, а повечето супрабазални клетки също са положителни.

Тези проучвания показват, че TAM67 има ясно влияние върху епидермалната функция. Интересно е обаче, че експресията на TAM67 не засяга роговичния епител (Фигура 5). Това откритие предполага, че не всички тъкани могат да реагират на нарушаването на функцията AP1. Не е ясно защо епителът на роговицата би бил устойчив на интерференция TAM67 с функцията на фактора AP1, но е интересно, че епителът на роговицата е силно устойчив на рак (Cutler, 2004).

материали и методи

TAM67 трансгенни мишки

Проучвания за канцерогенност

Антитела и имунологични методи.