Обобщение

Настоящата статия описва генерирането и метаболитната характеристика на мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, като модел на индуцирана от диетата инсулинова резистентност и затлъстяване. Също така има подробни протоколи за извършване на орален глюкозен толеранс и инсулинов толеранс, мониторинг на цялото тяло, промени в метаболизма на глюкозата in vivo.

изследване

Резюме

Въведение

В развитите страни затлъстяването и диабетът достигнаха епидемични измерения поради физическо бездействие и прекомерна консумация на преработени храни, последици от бързата урбанизация, индустриализацията и глобализацията. Въпреки че изследванията върху инсулиновата резистентност и нейните съпътстващи заболявания, като хиперлипидемия и атеросклероза, придобиват голямо значение през последните десетилетия, сложните биологични механизми, които регулират метаболизма в здравето и заболяванията, остават неразбираеми и все още има спешна нужда от нови начини на лечение за предотвратяване и лечение тези заболявания 1 .

Инсулинът и неговите контрарегулаторни хормони глюкагон служат като основни регулатори на клетъчното енергийно снабдяване и баланса на макроелементите, като по този начин поддържат адекватни системни концентрации на глюкоза в кръвта 2. Самата глюкоза действа като един от основните стимулатори на секрецията на инсулин от β-клетките на панкреаса, докато други макронутриенти, хуморални фактори като невронни входове допълнително модифицират този отговор. Следователно инсулинът задейства анаболните процеси в храненото състояние, като улеснява дифузията на излишната кръвна глюкоза в мускулните и мастните клетки и допълнително активира гликолизата, както и синтеза на протеини или мастни киселини, съответно. Освен това инсулинът потиска отделянето на чернодробна глюкоза чрез инхибиране на глюконеогенезата. Хроничната излишна консумация на енергия и мета-възпалението водят до хиперинсулинемия и периферна инсулинова резистентност поради понижаване на експресията на инсулиновия рецептор, както и промени в сигналните пътища надолу по веригата, което води до нарушена чувствителност към медиирано от инсулин изхвърляне на глюкоза, както и недостатъчно инхибиране на производството на чернодробна глюкоза 3, 4, 5, 6 .

Широка гама от животински модели с генетична, хранителна или експериментална индукция на болестта се оказаха отлични инструменти за изследване на молекулярните механизми на инсулинова резистентност и различни форми на диабет, както и придружаващите го заболявания 7. Пример за това е широко използваният и утвърден HFD-индуциран модел на мишка, който се характеризира с бързо увеличаване на теглото поради увеличен хранителен прием в комбинация с по-ниска метаболитна ефективност, което води до инсулинова резистентност 8, 9. Както при животински, така и при човешки модели, повишаването на нивата на кръвната захар и инсулин на гладно, както и нарушената толерантност към прилагането на глюкоза се използват като показатели за инсулинова резистентност и други системни нарушения на метаболизма на глюкозата. Проследяването на нивата на глюкоза и инсулин в кръвта на изходно ниво или след стимул е лесно достъпно отчитане.

Като цяло, ние предлагаме прост протокол за генериране на HFD-индуциран модел на мишка, като същевременно описваме по-нататък два мощни подхода за изследване на метаболитните нарушения в цялото тяло, САЩ и ITT, които могат да бъдат полезни инструменти за изследване на патогенезата на заболяване и разработването на нови терапии, особено в областта на заболявания, свързани с метаболизма като инсулинова резистентност и диабет.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички методи, описани тук, са одобрени от Грижата за животните и използването на Виенския медицински университет и се извършват съгласно Федерацията на европейските лабораторни асоциации за научни животни (персонал). Моля, обърнете внимание, че всички процедури, описани в този протокол, трябва да се извършват само след одобрение от институцията и правителството, както и от персонал, който е технически компетентен.

1. HFD-хранени мишки

Забележка: Поддържайте всички мишки C57BL/6J на 12-часов цикъл светлина/тъмнина със свободен достъп до храна и вода.

  1. На 6-седмична възраст мишките поставят за 8-12 седмици HFD (40-60% калории от мазнини), за да предизвикат затлъстяване, като същевременно хранят слабата контролна група с нискомаслена диета (LFD) (10% калории от мазнини).
  2. Седмично определяйте телесното тегло на мишките. Кривите на теглото трябва да показват сходни модели и в двете групи, с по-голям наклон в групата, захранвана с HFD.

Забележка: Ако точките за вземане на кръвни проби са избрани по време на OGTT на всеки 15 минути, експериментът трябва да се извърши с максимум 15 мишки паралелно, за да има поне 1 минута време за работа на мишка.

Забележка: Същите предпазни мерки, описани за OGTT (боравене с мишки, кръв, глюкомер и използване на вазелин) също трябва да се прилагат при извършване на ITT. Например, всички инжекции трябва да се извършват в рамките на 15 минути на интервали от 1 минута, ако паралелно се тестват 15 мишки. За ITT последващото събиране на кръвни проби с капилярни епруветки не е задължително.

10 минути при мишки 13, крайните разлики след приложението на инсулин (например след 2 часа) не могат да отразяват директен ефект от действието на инсулина. Прилагайте 20% разтвор на глюкоза в случай на хипогликемична мишка (нива под 35 mg/dL глюкоза в кръвта) и има риск от смърт.

  • След последните точки, поставете мишките в домашните им клетки, приготвени с много храна и вода.

    • Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    Фиг. 1 показва график за метаболитно фенотипизиране на мишки на диета. На възраст около 6 седмици, мишките трябва да бъдат поставени в HFD, докато групата с LFD може да служи като контролна група. Важното е, че телесното тегло трябва да се определя ежеседмично, за да се види дали има очаквано нарастване на телесното тегло. Всеки тип стрес (напр. Шум или агресивно поведение от мъжки пол) може да попречи на увеличаването на телесното тегло и трябва да се елиминира незабавно. Всяка кохорта от мишки за диетичните експерименти трябва да се състои от поне 10 мишки, тъй като тези диетични експерименти са бавни и цъфтежът е чест (напр. Мишки, които не наддават на тегло или мишки с необичайни нива на глюкоза или инсулин). След избрания период от време (в зависимост от хипотезата на изследването и времето на очакваните промени), OGTT и ITT могат да се извършват за оценка на инсулиновото действие и глюкозния толеранс. В тази работа бяха избрани последни моменти за метаболитния тест.

    Важно е, че трябва да има време за възстановяване от поне 1 седмица между OGTT и ITT, тъй като тези експерименти водят до значителна загуба на кръв и следователно са много стресиращи за мишките. Ако обемите за вземане на кръв се намалят (например, ако първо се извърши ITT без допълнително вземане на кръв), този период на възстановяване може също да бъде съкратен или пропуснат, в съответствие с насоките за многократно вземане на кръв при животни 14, 15, 16, 17 .

    В това голямо проучване с общо 60 мишки C57BL/6J, половината от мишките са фиксирани в HFD или LFD на възраст от 6 седмици (n = 30 група) и наддаването на телесно тегло се наблюдава в продължение на 16 седмици на диета. Консумацията на HFD доведе до значително увеличение на телесното тегло, както е показано на фигура 4. На 6-седмична възраст телесното тегло е било 20,2 g и в двете групи. Докато мишките с LFD показват постоянно, леко нарастващо телесно тегло (31,2 g ± 2,7) през наблюдавания период, мишките с HFD бързо увеличават телесното си тегло, особено през първите седмици и достигат максималното си телесно тегло след това. диета. Въпреки че кривите на теглото показват подобен модел по време на експеримента, мишките от групата с HFD постигат 1,5 до 2 пъти по-голямо телесно тегло (44,4 ± 4,0 g) в сравнение с мишките, хранени с LFD.

    За да изследват метаболитния фенотип на двете кохорти, те извършиха OGTT (Фигура 5) и ITT (фигура 6). Тъй като обемът на кръвта е ограничен при малки гризачи, за наблюдение на нивата на кръвната глюкоза по време на експерименти с метаболитно фенотипиране се използва анализ на точката на грижа (POC) за хора с диабет (глюкомер). Както е показано на фигура 2, Мониторите за кръвна захар са лесни за използване, трябва ви само малка капка кръв и да покажете нивата на кръвната захар в рамките на секунди за документация. Фигура 5 представя времевия ход на абсолютния инсулин и абсолютната глюкоза (Фигура 5а-б) (фигура 5 c) нива по време на OGTT. Обикновено здрава мишка с нормален глюкозен толеранс показва характерно бързо покачване на кръвната глюкоза, достигайки своя пик 15-30 минути след глюкозата.

    Последващото усвояване на глюкоза, извършвано главно от мускулна, мастна тъкан и чернодробна тъкан, води до постепенно намаляване на концентрацията на глюкоза в кръвта. Във всички експерименти мишките, хранени с LFD, служат като контролна група, поносима към глюкоза и следователно отговарят на очаквания метаболитен профил: пиковите нива на кръвната захар на

    240 mg/dL е достигнато приблизително 15 минути след прилагане на глюкоза, веднага последвано от намаляване, достигащо изходни нива приблизително 60 минути след глюкоза, което показва адекватен глюкозен клирънс. За разлика от това, HFD-мишките достигнаха приблизително

    320 mg/dL глюкоза и не показва почти никакво разположение на глюкоза, което показва резистентност към глюкоза. Когато нивата на кръвната глюкоза между двете групи вече се различават в състоянието на гладно (както в този пример), трябва да се извърши изчисляване на площта под кривата (AUC) върху базалната глюкоза, за да се потвърдят резултатите (Фигура 5а- б).

    В допълнение, нивата на циркулиращия инсулин в кръвта се определят с помощта на инсулинов тест ELISA (Фигура 5в), за да се предостави повече информация за основната патофизиология в този модел. Докато нивата на инсулин бяха почти непроменени в контролната група, мишките, хранени с HFD, демонстрираха 16-кратно повишение в сравнение с контролната група, както и силно повишен инсулинов отговор, което показва HFD-индуцирана хиперинсулинемия. намаленият елиминационен капацитет на глюкозата, който може да бъде причинен от инсулинова резистентност. Моля, имайте предвид, че не трябва да се тълкуват прекомерно резултатите от OGTT, този тест не оценява пряко действието на инсулина и не трябва да се използва за заключение на твърдения за инсулинова резистентност.

    За измерване на инсулиновата чувствителност при мишки, хранени с HFD, се извършва ITT 1 седмица след OGTT (Фигура 6а). В този тест степента, в която концентрациите на глюкоза в кръвта падат след прилагане на инсулин, представлява ефективността на действието на инсулина в тялото. Мишките, хранени с HFD, показват влошено намаляване на нивата на кръвната захар в сравнение с контролната група, хранена с LFD, във всички времеви точки на ITT, което предполага инсулинова резистентност. Обикновено резултатите от ITT се представят като времевия ход на нивата на глюкозата, но също така и обратното, че AUC под базалната глюкоза може да се покаже, както е показано на фигура 6b. Ако групите, които се сравняват, имат сходни нива на глюкоза на гладно (което не е така в този експеримент), нивата на глюкозата по време на ITT могат да бъдат представени като процент на базалната глюкоза. Както при мишките, контрарегулаторен отговор на инсулин се активира, ако нивата на кръвната захар спаднат под

    80 mg/dL 18: дефектите в този контрарегулаторен отговор при определен модел на мишка могат да бъдат погрешно интерпретирани като повишаване на чувствителността към инсулин. По време на HFDs и последващи метаболитни фенотипични експерименти, често могат да се появят излизания. Мишките, които не напълняват с HFD, или тези с ненормални нива на глюкоза или инсулин на гладно трябва да бъдат изключени от анализа. За последните две може да се извърши изолиран тест за всяка експериментална група поотделно (например тест на Грубс).

    В това проучване, като пример, демонстрирахме да интерпретираме данни от метаболитни експерименти in vivo, проведени при мишки с индуцирано от диетата затлъстяване, непоносимост към глюкоза и инсулинова резистентност и сравнени с контролна група с нормално телесно тегло. Както се очакваше, имаше нарушен глюкозен толеранс и хиперинсулинемия при постоянно затлъстели мишки, устойчиви на инсулин, в сравнение с контролните мишки, съпоставени с възрастта; Това беше открито с помощта на утвърдени и надеждни, навреме и бюджетни методи, които са сравнително лесни за изпълнение. Разликите в глюкозния толеранс, нивата на инсулин, както и инсулиновата чувствителност, които всички се получават чрез настоящите методи на OGTT и ITT, често могат да помогнат за планирането на следващите стъпки от проучване, което може да включва по-сложни експерименти, като хипергликемични или хиперинсулинемични скоби както и експерименти с изолирани панкреатични островчета.


    Фигура 1. Графична схема за предложен режим на диета и in vivo метаболитни експерименти. За да се изследват метаболитните ефекти на HFD при мишки, животните от експерименталната група се поставят в HFD на приблизително 6-седмична възраст, докато контролната група получава LFD. Телесното тегло на мишките трябва да се определя ежеседмично, за да се оцени адекватното наддаване на тегло. След приблизително 12 седмици диета (или избран времеви момент в зависимост от хипотезата на изследването), метаболитният фенотип на мишките се оценява чрез OGTT, последван от 1 седмица време за възстановяване и впоследствие ITT. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


    Фигура 2. Методи за вземане на кръвни проби по време на метаболитни експерименти. За употреба, както и за ITT, където се изисква многократно вземане на кръв, се препоръчва да се вземе кръв чрез внимателно отрязване на 1-2 мм парче от върха на опашката с остри ножици (вариант А), последвано от определяне на кръвната захар нива с глюкомер и по-нататъшно събиране на кръв с капиляр за определяне на нивата на инсулин и други съответни стойности в кръвта. Алтернативно, кръв може да се вземе и чрез опашната вена (вариант Б) или чрез артериална катетеризация (не е показана). Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


    Фигура 3. Перорална глюкозна сонда (a) и интраперитонеално инжектиране на инсулин (b). Представителни изображения на перорално приложение на глюкоза с помощта на игла за хранене по време на OGTT (а) и интраперитонеална инжекция на инсулин по време на ITT (б). Вижте протокола за подробно описание. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


    Фигура 4. Повишаване на теглото на мишки C57BL/6J, хранени с HFD и LFD-хранено тяло. C57BL/6J мишки ще лекуват или 60% HFD, или 10% LFD, за да служат като контрола, за период от 20 седмици. Докато мишките, хранени с HFD, показват очаквано увеличение на телесното тегло, особено през първите няколко седмици на диета, мишките, хранени с LFD, показват почти постоянно телесно тегло през наблюдавания период. Резултатите са средната стойност ± SEM. * p Необходим абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Дискусия

    Подходите, описани тук на OGTT и ITT, често могат да обяснят наблюдаваните разлики в толерантността към глюкозата и могат допълнително да служат за предположение, че по-късно ще се извършват по-сложни експерименти, както следва (например хипергликемични скоби или проучвания в изолирани островчета). В обобщение представяме прост протокол за генериране на HFD-индуциран модел на мишка и по-нататък описваме OGTT и ITT, които са мощни инструменти за оценка на промените в метаболитния фенотип in vivo и могат да бъдат полезни за изследване на механизмите на свързано с метаболизма заболяване, както и нови терапевтични подходи.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.