Новата техника революционизира генното инженерство. Но дали молекулярните ножици CRISPR/Cas9 са толкова изгодни, колкото обещават?
Техниката за редактиране на гени CRISPR/Cas9 работи като селективни ножици, които с голяма точност и ефективност изрязват и модифицират всяка последователност на генома. Но винаги ли са надеждни? [iStock/vchal]
Генното инженерство изпитва тласък за обновяване. Десетилетие след проекта за човешкия геном, който не даде всички очаквани резултати, се появи техника, чиито възможности изглеждат безкрайни. CRISPR/Cas9, молекулярни ножици, които модифицират ДНК в избрани точки с безпрецедентна точност, пораждат нова надежда. Стратегията вече революционизира всички области на генното инженерство и се счита за безспорно, че нейните откриватели ще бъдат достойни за Нобелова награда. Методът обаче не е без проблеми. Нежеланите ефекти, които може да причини, техническите ограничения и етичните възражения представляват основни пречки пред редактирането на гени.
Как работи CRISPR/Cas9?
Техниката за редактиране на гени CRISPR/Cas9 се основава на сложна имунна система от бактерии, която ги предпазва от вируси. Това е придобит или адаптивен имунитет, който „помни“ ДНК последователностите на патогените от предишни атаки и отрязва тяхната ДНК в случай на нова инфекция.
Именно тази комбинация от разпознаване и рязане използва техниката CRISPR/Cas9. В най-простия вариант РНК, кодираща протеин, наречен Cas9, и последователност за разпознаване се инжектира в клетката. Клетката използва РНК, за да синтезира протеина, който се включва заедно с добавената РНК за разпознаване: Cas9 отрязва двуверижната ДНК точно там, където асоциираният РНК фрагмент му казва. Тъй като е възможно изкуствено да се синтезира всяка РНК последователност, такава комбинация дава възможност да се изреже всеки геном навсякъде, поне теоретично.
Така наречените CRISPR последователности, присъстващи в генетичния материал на бактериите, са известни от 80-те години на миналия век. Микробиологът Франсиско J. M. Mojica от Университета в Аликанте допринесе в основна част за тяхното откриване и именуване. Съкращението означава „редовно разположени клъстерирани кратки палиндромни повторения“, тоест повтарящи се къси палиндромни последователности, които са разделени от друг генетичен материал и които често се появяват в генома на определени места. Оказа се, че генетичният материал между повтарящите се последователности често идва от вируси, което ни позволява да заключим, че CRISPR съответства на система, която позволява на бактериите да се защитават срещу тях.
По-късно се забелязва, че всички бактерии с тази система са имали, в близост до CRISPR, свързани гени, които се наричат cas. Те представляват съществения елемент на антивирусната защита. Системата CRISPR на бактерията „добива“ вирусна ДНК и интегрира части от нея сред повтарящите се последователности на бактериалния геном. В резултат на това клетката произвежда РНК, допълваща вирусната ДНК, и я сглобява с Cas протеини. Ако вирус се опита да реинфектира клетката с тази ДНК, РНК „разпознава“ генома на вируса и след това протеините Cas го режат, за да не причинява отново щети.
Произходът на техниката за редактиране на гени се основава на откритието, че Cas протеините режат всяка ДНК, стига да са снабдени с подходяща РНК за разпознаване и това прави CRISPR/Cas9. След изрязването се разчита на естествените възстановителни механизми на клетката, които започват спонтанно.
Ако по това време са разделени само двете части на генома, се намесва клетъчен възстановителен механизъм, който ги свързва отново, въпреки че често е неточен и произвежда така наречените индели, малки ДНК фрагменти, които се вмъкват или елиминират в точката на рязане и че може да деактивира участващите гени. Когато обаче ДНК плава свободно в клетката с двата свободни края, се намесва друга по-точна система, наречена хомоложна рекомбинационна поправка (HDR), която ги свързва отново и води до специфични промени в генома.
Какви са етичните въпроси?
Експертите отдавна обсъждат основните етични проблеми, свързани с генетичната модификация при хората. Но до този момент дебатът беше чисто хипотетичен, тъй като процедурите бяха твърде груби и неточни, за да могат да ги превърнат сериозно в човешки изпитания. Но генното редактиране позволява по принцип да се въвеждат промени в генома с висока точност. Всъщност още през 2015 г. няколко китайски работни групи съобщиха, че използвайки метода CRISPR/Cas9, те са се опитали да елиминират някои наследствени заболявания от човешки ембриони. Понастоящем възстановяването на гени, причиняващи заболявания, е най-очевидното приложение при хората, тъй като никой не може да възрази срещу терапевтичните му цели.
Или всъщност да? Критиците се опасяват, че подобни процедури допълнително ще отложат дефиницията на "генетичен дефект", докато всички, освен най-необходимите генетични варианти, се считат за дефектни и поради това се нуждаят от поправка. По този начин дизайнерското бебе, направено по мярка, обект на много повече или по-малко полезни съображения относно етиката на модификациите в зародишната линия, ще се появи под предлог за излекуване.
Най-належащият проблем обаче не са възможните последици от дизайнерските бебета, а по-скоро последиците, които подобни експерименти ще имат с оглед на необикновено непълното познаване на действителните генетични ефекти. Изследванията за създаване на „персонализирано“ бебе могат да отнемат десетилетия, но не е ясно дали такова чакане ще възпира всички. Може би такива експерименти просто са забранени, тъй като през 2015 г. експериментите увеличават заразността на някои вируси.
Напротив, премахването на наследствените заболявания вече е на дневен ред. В някои случаи коригирането на отделен ген или може би на един алел вероятно ще бъде възможно скоро. Повечето експерти смятат, че тази опция е етично оправдана. Въпреки това, дори в този случай съществува риск намесата да има непредсказуеми дългосрочни последици, ако например коригираният ген се предаде на потомството и има ефекти върху тях, които никой не е очаквал. В последно време изненадващото съобщение на китайски изследовател, че е родил близнаци с генома, редактиран да ги предпазва от ХИВ, предизвика огромни противоречия.
Днес CRISPR/Cas9 и свързаните с него методи вече революционизират всички области, в които генетичната модификация може да представлява интерес. Редактирането на гени е по-лесно и по-точно от всяка друга техника, разработена досега. Но на първо място, трябва да е ясно какво се разбира под „генетично модифициран организъм“: дали е такъв с ген, модифициран от CRISPR/Cas9 на едно място? Или току-що е добавил нов вариант към естествения си генофонд? Е прасе без своите ендогенни ретровируси като всяко друго прасе?
Ще бъде интересно да се види реакцията на потребителите, когато такива организми заемат рафтовете на супермаркетите като продукти на прага между „естествен“ и „изкуствен“. В този момент най-късно истинският технически въпрос за дефиниране на генното инженерство ще стане емоционален. Много хора не искат да видят на чинията си нищо, което да е „генетично модифицирано“; но това ще изисква разпознаване на модифицирани организми, дори ако променените им гени не се различават от естествените варианти и следователно могат също да хибридизират с непроменени организми. Подобна прозрачност едва ли би била възможна при сегашната система, особено по отношение на животновъдството.
Етичните съображения около CRISPR/Cas9 също се отнасят/балансират между предвидените ползи и рискове от техниката, като например възможността за модифициране на нежелани места в генома. Екосистемите също могат да бъдат застрашени, когато комарите или генетично модифицираните селскостопански продукти бъдат пуснати в природата. Също така не е ясно какъв е рискът модифицираният генетичен материал да прескочи до други видове. От друга страна е трудно да се предвидят последиците от отказването от техниката, когато се опитва да излекува болест. В този случай противопоставянето на мощния CRISPR/Cas9, въпреки основните му недостатъци, е не по-малко противоречиво.
Какви са ограниченията на CRISPR/Cas9?
По своя биологичен произход CRISPR/Cas9 е инструмент за унищожаване: пробив в двойна верига представлява доста драстична намеса на генома и често не може да бъде възстановен, без да остави трайни увреждания. Това свойство може да бъде полезно, когато се опитвате да деактивирате ген чрез така наречените indels: базови двойки, които се премахват или добавят и правят раздела на генома нечетлив. За съжаление, инделите също се произвеждат понякога, когато се добави допълнителна ДНК чрез системата за възстановяване на HDR.
Ако се изисква генетична модификация с висока точност, както при генните терапии, двуверижните прекъсвания в оригиналната система CRISPR следователно са основен проблем, който човек иска да избегне. По-новите варианти CRISPR/Cas9 например изрязват само една нишка, значително намалявайки инделите на нежелани места в генома и значително подобрявайки прецизността на техниката.
И все пак нежеланите промени в системата CRISPR/Cas9, които се случват на места в генома, различни от предвиденото, никога не могат да бъдат избегнати напълно. Те могат да се осъществят, тъй като режещият ензим Cas9 работи дори ако разпознаващата РНК се различава от ДНК последователността на до пет места. Такива грешки са изключително трудни за идентифициране по-късно. Или обратният ефект може да възникне при гени, за които се предполага, че са инактивирани: въпреки че желаната мутация е включена на правилното място в генома, генът продължава да се „чете“ правилно.
Настоящата техника CRISPR/Cas9 има и други проблеми. Въпреки че може прецизно да изреже определено място от генома, той изисква специфична генна последователност да съществува в непосредствена близост, която не може да бъде избрана по желание. Такъв е случаят с повечето геноми, макар и не с всички (и, разбира се, никога с този, върху който работи). Освен това, машината CRISPR/Cas е много обемна, което затруднява въвеждането в ранните ембрионални клетки на бозайници: генът cas и разпознаващата РНК са просто прекалено големи за често използваните генетични "транспортери", вируси, които въвеждат генетичен материал в клетката на интереси. РНК трябва да се инжектира директно, ограничавайки ефикасността.
Всъщност един от най-важните параметри на техниката за редактиране на гени е нейната ефективност; С други думи, в каква пропорция целевият геном се модифицира по желания начин. Нито една от използваните днес генетични ножици не гарантира, че ще изпълнят мисията си; всъщност вероятността те да го направят е относително ниска, дори в някои от най-обещаващите приложения. CRISPR/Cas9 всъщност не участва в редактирането на интересуващия ген. Това се случва повече или по-малко случайно. Например при индуцирани плурипотентни човешки стволови клетки ефикасността на CRISPR/Cas9 е между 2 и 5 процента. В други системи, като ембрионите от риба зебра, вероятността за успешна мутация понякога е над 70%, въпреки че генната терапия за наследствени рибни заболявания не е много голям пазар.
Какви ще бъдат бъдещите приложения на CRISPR/Cas9?
В биотехнологичните изследвания CRISPR/Cas9 постигна отлична позиция като инструмент за генно инженерство. Дори се стигна по-далеч с нови версии, които позволяват специфично регулиране на генната активност в лабораторията. За това се използва инактивиран Cas9 протеин, който само здраво се придържа към определени парчета ДНК. Ако такъв протеин се свърже с промоторен домен, активността на съответния ген се увеличава. Ако вместо това блокирате последователността на самия ген, съответният геномен сектор спира да се транслира в РНК. С помощта на различни протеини, свързани с неактивни системи Cas9, вече е възможно да се изследват и епигенетични ефекти, например чрез флуоресцентно маркиране на пространственото положение на определени последователности. Чрез асоциирани ензими, които разцепват или свързват метилова или ацилна групи, такива системи CRISPR/Cas9 могат също да променят епигенетиката на клетките.
Но преди всичко CRISPR/Cas9 в момента се използва за много ефективно създаване на генетично модифицирани организми, такива, при които определен ген е модифициран, вмъкнат или инактивиран чрез мутация. Такива процедури са много по-стари от CRISPR. През 2007 г., например, изобретателите на така наречения генетичен нокаут бяха отличени с Нобелова награда за физиология или медицина. Техниката CRISPR/Cas9 обаче е по-бърза, по-евтина и по-гъвкава от предишните методи. Един от основните проблеми на CRISPR може да бъде решен и в лаборатория: необходимият размер на РНК. Понастоящем например има няколко щама мишки, които носят протеина Cas9 в собствения си геном; веднага щом определен молекулен сигнал, като съответната РНК за разпознаване, достигне клетката, молекулата изчаква да промени генома.
В ход са и първите модифицирани организми, чиято цел, извън основните изследвания, има практически приложения. По този начин, ако плановете на учените са успешни, в бъдеще ще се произвеждат по-добри животински модели за различни човешки болести, както и култури и животни с определени характеристики, като например резистентни на малария комари Anopheles. Интересен пример е елиминирането в генома на свинете на потенциално опасни ретровируси, важно изискване преди плана за генериране на човешки органи при животни.
В допълнение, CRISPR/Cas9 е усъвършенствал техника, наречена генно задвижване, механизъм, чрез който някои изкуствени черти бързо се разпространяват в популациите на дивите животни. Това е интересно за борба с комарите, които пренасят сериозни заболявания в някои региони. Медицинските изследвания са се фокусирали и върху CRISPR/Cas9 като инструмент за борба с патогенните вируси и бактерии, за да се направят точни съкращения в ДНК на тези микроорганизми и да се предотврати процъфтяването им. Все още обаче не е напълно ясно как да се транспортира необходимата РНК до желаното място при истинско заболяване.
Какви алтернативи съществуват на техниката CRISPR/Cas9?
Едно е сигурно: въпреки решението по патентния спор между Еманюел Шарпентие и Дженифър Дудна, от една страна, и Фън Джанг, от друга, битката за ползите от метода CRISPR/Cas9 едва сега започна. Поради огромния потенциал на техниката, лицензионните възнаграждения се броят в милиарди. Но ако погледнете в перспектива, може би не. Докато Калифорнийският университет все още е в състояние да получи поне парче от пая, различни изследователски групи проучват други възможности за техниката.
Тъй като CRISPR/Cas9, както видяхме, има недостатъци и ограничения. Най-важното е, че генетичните ножици всъщност са подходящи само за изрязване на ДНК. Ако искате да включите нов генетичен материал, трябва да се доверите на клетката. В много случаи техниката не е достатъчно ефективна, за да модифицира няколко гена едновременно, както желаете. Освен това CRISPR/Cas9 не нарязва на всички сайтове на генома.
Поради тази причина методите, предшестващи CRISPR/Cas9, не са напълно изоставени: както TALEN, така и нуклеазите на цинковите пръсти, два по-стари типа генетични ножици, все още се използват в генното инженерство. Тези процедури са много по-сложни. Ако обаче, в допълнение към недостатъците на CRISPR/Cas9, несигурността относно лицензионните такси продължава повече години, експертите могат да се отдалечат от CRISPR/Cas9, поне когато става въпрос за изследвания с възможни търговски приложения.
Изследванията на други варианти също продължават. През пролетта на 2016 г. китайска изследователска група публикува работа, в която се посочва, че протеин, наречен NgAgo, е направил същото като CRISPR/Cas9, дори по-добре. Но резултатите се оказаха преждевременни. Както се случи с вълнението, че възбуди протеин, наречен ламбда червен, за който се предполага, че има реалната способност да редактира гени и който е изследван от Джанг, пионер на CRISPR, в продължение на 14 години без особен успех.