За:
Хуан Карлос Медина Б.
Елиезер Кастило
Въведение
Микотоксините са вторични метаболити с ниско молекулно тегло, произведени от гъбички, които причиняват патологични ефекти при хора и животни.
14.2. Разработване на имунохимични методи
Тъй като микотоксините не са антигенни, първите проучвания, които бяха разработени, бяха в смисъл да се постигне конюгация с протеини или полипептиди, които биха могли да служат като транспортери в оптималните условия за производство на антитела при зайци и други животни. С напредъка в технологията са произведени моноклонални антитела срещу различни микотоксини. Това развитие се е увеличило през последните 8 години. В таблица 14.1. представено е настоящото съотношение на наличните микотоксинови антитела.
Както може да се очаква, са разработени различни видове имуноанализи, сред които се открояват ELISA (ензимно-свързани имуноанализи), RIA (радиоимуноанализи) и имуноафинитетни колони. Повечето от тези методи са много чувствителни, специфични и лесни за работа. С което се появи измерение по отношение на методологията за анализ на микотоксините.
Преди да пристъпим към обсъждането на различните видове имуноанализи, трябва да вземем предвид следното:
Тъй като повечето имуноанализи се основават на конкуренция за местата на свързване на молекулите на антителата между токсините, присъстващи в пробата, и маркираните токсини, характерни за системата, конюгирани микотоксини. Следователно е необходимо да имате перфектно маркиран микотоксин в допълнение към специфичното антитяло в системата за анализ.
Необходимо е да има добър метод за извличане на микотоксини и адекватна процедура за разделяне на свързани и свободни токсини.
Трябва да се знае степента на специфичност на антителата, омрежващи, срещу аналогични съединения.
Тъй като винаги има възможност даден компонент на пробата да реагира с антителата, е необходимо да се проучи подробно всеки тип матрица, преди да се извършат съответните тестове.
Процедурите за почистване на екстракти не са необходими за повечето системи за имуноанализ. По такъв начин, че екстрактът от твърдата матрица да може да се използва директно в теста, след разреждане с буферен разтвор, характерен за самата система. Чувствителността на определянията обаче се увеличава, когато се използва адекватна процедура за почистване на екстрактите.
| Афлатоксини: B1, B2, G1 | Моят P |
| Афлатоксинови метаболити B2a, Q1, M1, Ro | Моят P |
| Циклопиазонова киселина | P |
| Ерготамин | P |
| Фузарохроманон | P |
| Фумонизин | М |
| Кожикова киселина | P |
| Охратоксин А | Моят P |
| PR токсин | P |
| Рубратоксин В | P |
| Секалонова киселина | P |
| Стеригматоцистин | P |
| Трихотецени: DAS, DON, FX, DOVE, NIV, T-2 и техните метаболити | Моят P |
| Зеараленон | Моят P |
| Патулин | P |
Източник: Чу, 1992 г.
14.2.1 Радиоимуноанализи (RIA)
Процедурата за радиоимуноанализ включва инкубацията на специфично антитяло едновременно с разтвор на проба или стандартен разтвор с известна концентрация и постоянно количество белязан токсин. След разделяне на свободните и свързани токсини, радиоактивността се определя във всяка от тези фракции.
Концентрацията на токсина в пробата се определя чрез сравняването й със стандартна крива, която се установява чрез нанасяне на съотношението на радиоактивността в свързаната фракция и свободната фракция спрямо логаритъма на концентрацията на немаркираните токсини.
Чувствителността на този тип анализ за микотоксини е обобщена в таблица 14.2, но като цяло този имуноанализ може да открие 0.25 до 0.5 ng от пречистения токсин. В случай на проби от храна, границите на откриване са от 2 до 5 ppb. Тази чувствителност може да се подобри с някаква процедура за почистване на екстрактите или чрез използване на радиоактивни маркери с висока активност, като микотоксини, маркирани със 125 I. Въпреки че тази техника е инструмент, който осигурява точни резултати, методът включва използването на радиоактивност, следователно използва се изключително в изследователски лаборатории и в някои промишлени съоръжения.
| AFB/AF | Царевица, пшеница, фъстъци | 1 - 10 |
| Афлатоксин М | Мляко | 0,01 |
| Деоксиниваленол | Царевица, пшеница | 300 |
| Охратоксин А | Царевица, пшеница | 5 |
| Токсин Т - 2 | Царевица, пшеница | 2,5 - 50 |
| Зеараленон | Царевица | 100 |
Източник: Чу, 1992 г.
14.2.2 Ензимно-свързани конкурентни имуноанализи (ELISA)
По принцип системата ELISA е приблизително 10 до 100 пъти по-чувствителна от радиоимунологичните тестове за пречистени микотоксини. Възможност за откриване на стойности до 2,5 pg чисти микотоксини.
Настоящото развитие на тези ELISA системи позволява определянето на афлатоксин, Т-2 токсин или дезоксиниваленол да се извършва за по-малко от един час след процеса на екстракция. Чувствителността на ELISA системата се подобрява, когато се извършват процеси за пречистване на екстракти. Чувствителността на ELISA системите е специфична за всеки микотоксин, Таблица 14.2. представя връзка за тази информация.
В индиректния ELISA анализ конюгат, образуван от микотоксина, свързан с протеин или полипептид, се имобилизира върху микротитърна плака. Плаката се инкубира със специфичното антитяло в присъствието и отсъствието на хомоложните микотоксини. След това количеството антитяло, свързано с протеиновия конюгат, имобилизиран върху плаката, се определя чрез реакция с IgG ензимен комплекс, който се предлага на пазара, и последваща реакция със субстрата. По този начин токсинът в пробите и токсинът в твърдата фаза се конкурират за едни и същи места на свързване със специфичното антитяло в разтвор.
Сред недостатъците на тази система е времето за получаване на резултати, от 2 до 3 часа, и проблемите при нейното използване. Следователно тези тестове изискват много по-голямо управление и специализация, поради което се провеждат само в изследователски лаборатории.
Тестовете за директни състезания се предлагат в търговската мрежа, като към днешна дата основните системи са: Aflatest, Aflacen (Куба), Biocode (Англия), Transia (Франция) и системи, произведени в Германия и Япония.
14.2.3 Бързи качествени тестове
Когато се стремите да получите качествена информация много бързо, е възможно да използвате директни или индиректни ELISA системи, които изискват по-кратки инкубационни периоди, в които концентрацията на антителата е коригирана. Разработени са предимно системи, при които антителата се имобилизират върху хартиен филтър или върху мембрана, която е монтирана или върху пластмасова карта (тест на екрана на картата), в пластмасова чаша (тест за чаша, Cite) или върху спринцовка (Cite сонда) (Dorner and Cole, 1990, Trucksess и др., 1990, Чу 1990, Стъбълфийлд, 1988). Реакцията се провежда върху навлажнена мембрана. След реакцията отсъствието или намаляването на цвета, обикновено син, на мястото, където е поставена пробата, показва наличието на токсина в пробата. Реакцията се провежда много бързо от порядъка на 10 до 15 минути.
14.2.4 Имуноафинитетни колони
Друга техника на имуноанализ включва използването на имуноафинитетна колона. При тази процедура моноклоналните антитела, специфични за определен микотоксин, се имобилизират, за да образуват гел, който се опакова в колона. Когато екстрактът от входна или готова храна се прекара през колоната, микотоксинът се комбинира със свързващите места на антитялото, докато останалите компоненти на екстракта не се комбинират, ние продължаваме да елиминираме всяко съединение, което има се задържа, микотоксинът впоследствие се елуира с метанолов разтвор. Полученият разтвор или се пропуска през система за течна хроматография, или се дериватизира и отчита на специално проектиран флуорометър. Има само двама производители на този тип колони Vicam (САЩ) и Biocode (Англия).
14.3. E оценка на имунохимичните анализи
Резултатите, получени с различните ELISA системи към днешна дата, са противоречиви, в ръцете на експерти има истинска корелация в сравнение с тънкослойните хроматографски техники и дори с високоефективна течна хроматография (Trucksess и др., 1990, Парк и др., 1989 а и б, Медина и др., 1990), докато при провеждане на съвместни проучвания с хора, които са експерти по аналитична химия, но без пълно овладяване на знания за основите на процеса, резултатите не са толкова точни (Dorner и др., 1993).
| Царевица | 5 | 22/26 | 4/26 |
| Царевица | 26 | 9/25 | 16/25 |
| Готова храна | 4 | 17/26 | 9/26 |
| Готова храна | 14. | 6/26 | 20/26 |
Източник: Парк и др., 1989 г.
През 1990 г. Министерството на земеделието на Съединените щати извърши оценка между системите ELISA и колона, наречена Holaday-Velazco, приета от международния AOAC като официален метод за качествени тестове (Koeltzow and Tanner, 1990).
| Царевица c.nat. | 24/24 | 24/24 | 146 | 140 | 101 |
| 30 | 24/24 | 22/24 | 27 | 26 | 29 |
| двайсет | 24/24 | 18/24 | 19. | 18. | двадесет и едно |
| 10 | 24/24 | 16/24 | 7 | 8 | единадесет |
| 0 | 24/24 | 24/24 | 1 | 1 | 0 |
| Бал храна. | |||||
| 30 | 24/24 | 20/24 | 27 | 17 | единадесет |
| двайсет | 12/24 | 11/24 | 8 | 6 | 7 |
| 10 | 24/24 | 23/24 | 4 | 4 | 5 |
| 0 | 24/24 | 24/24 | 0 | 0 | Таблица 14.5. Сравнение на резултатите между имуноанализи и колона Holaday Velazco за определяне на афлатоксини |
| ИФА № 1 | И | М | И | ||
| Имуноафинитет | И | И | И | ||
| ELISA № 2 (видим) | R | R | R | ||
| ELISA № 2 (четец) | R | R | R | ||
| ELISA № 3 (карта) | И | И | И | ||
| ИФА № 4 | И | И | И | ||
| SAM-A колона | И | И | И |
Източник: Koeltzow и др., 1990 г.
| 62 ppb | 100 |
| 24 ppb | петдесет |
| 2 ppb | 100 |
| Изкуствено замърсяване n = 24 | % посещения |
| 40 ppb | 83.7 |
| 24,5 ppb | петдесет |
| 1 ppb | 100 |
Източник: Медина и др., 1990 г.
| 0,0 | 4.7 | 2.0 | 0–0 | 0–346 | 0–220 |
| 13.1 | 10.7 | 12.0 | 12–14 | 1–29 | 0–81 |
| 28.1 | 19.7 | 20.2 | 24–30 | 0–33 | 0–62 |
| 78.9 | 43.1 | 45.3 | 70–95 | 28–101 | 2–75 |
| 211.4 | 178,9 | 125.9 | 196–238 | 12–400 | 34–440 |
| 303.8 | 139.8 | 160.4 | 263–323 | 80–204 | 76–270 |
Източник: Dorner и др., 1993 г.
| 0 | 2.4 | 0 | 0 |
| 10 | 8.0 | 8.6 | 10.2 |
| петдесет | 44.4 | 48.4 | 50.6 |
| 150 | 143.5 | 136,0 | 144.4 |
| 300 | 303,0 | 282,0 | 316.2 |
| 400 | 422.4 | 376,0 | 416,0 |
Източник: Neogen, 1992. Средни резултати от 5 определяния.
14.4. Включения
Анализите на микотоксини са много трудни, тъй като те присъстват в количества от порядъка на ng/g (ppb), особено в готовите храни. През последните 8 години обаче се наблюдава много забележимо развитие в прилагането на имунохимични тестове. Тези техники направиха възможно опростяването на аналитичните процеси по такъв начин, че да направи революция по отношение на аналитичните съоръжения. Друг аспект е фактът, че на пазара се предлагат по-чувствителни и гъвкави инструменти. По такъв начин, че имуноанализите представляват алтернатива, въпреки че не може да се счита, че тези системи вече са напълно усъвършенствани. Въпреки това, този напредък в аналитичната химия е от такава стойност, че наградата от международния AOAC за 1993 г. бе присъдена на д-р Pestka J. J., един от пионерите в тази област. И накрая, счита се, че цените ще имат тенденция да падат, тъй като има повече търговски марки.
14.5. Библиография
Чу, Ф.С. Имуноанализ за микотоксини, съвременно състояние, търговски и епидемиологични приложения. Ветеринар. Човешки токсиксол. 32 (Suppl.): 42, 1990.
Чу, Ф.С. Последен напредък в аналитичните техники за микотоксини във фуражите. J. Anim. Sci.: 70, 3950–3963, 1992.
Чу, F.S., Trucksess, M.W. и Парк, D.L. Оценка чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ за тънкослойна хроматография на афлатоксин В1 в царевица, фъстъци и фъстъчено масло. Й. доц. Изключено. Анален. Chem. 71: 126, 1989.
Дорнър, Дж. и Коул, R. Сравнение на два скрининг теста ELISA с течна хроматография за определяне на афлатоксини в сурови фъстъци. Й. доц. Изключено. Анален. Chem. 72: 962, 1989.
Koeltzow, D.E. и Танер, S.N. Сравнителна оценка на предлаганите в търговската мрежа методи за тестване на афлатоксини. Й. доц. Изключено. Анален. Chem. 73: 584, 1990.
Medina, J.C. и Ромеро, М. Сравнение на един скринингов тест ELISA с течна хроматография за определяне на афлатоксин В1 в сорго. Тези на 104-тата годишна международна среща на Асоциацията на официалните аналитични химици. 1990 г.
Неоген. Техническа информация за Veratox и Agri-Screen. 1992 г.
- КОНТРОЛ ЗА КАЧЕСТВО НА АКВАКУЛТУРНИ ВХОДИ И ДИЕТИ
- Конфронтацията стига до парите, които се начисляват за диетите и контрола на субсидиите
- Болницата засилва контрола си върху качеството на 270 диети, сервирани за Идеален ден
- Метаболитен контрол на захарен диабет във връзка с качеството на медицинските досиета -
- Метаболитен контрол на захарен диабет във връзка с качеството на медицинските досиета -