пшеницата

  • Обобщение
  • Въведение
  • Методи
  • Уча дизайн
  • Хранителни дневници
  • Екстракция на DON в урината
  • LC-MS анализ на извлечен DON
  • Анализ на креатинина
  • Статистически анализ
  • Резултати
  • Дискусия
  • Терминологичен речник

Обобщение

Методи

Уча дизайн

Изследването е проведено за период от 7 дни и включва 25 доброволци, 16 жени и 9 мъже, на възраст между 21 и 59 години. На 1 и 2 ден ("нормална диета") се поддържаха дневници със средно тежка храна и на 3 ден се получава празна проба от урина от първата сутрин. На 3–6-ия ден („намалена интервенция с пшеница“) доброволците бяха помолени да ограничат приема си от определен списък с храни, които е вероятно да съдържат пшеница (хляб, сладкиши, тестени изделия, зърнени закуски и др.) И замени с предмети от списък на предложените алтернативи (напр. ориз, картофи). На 5 и 6 ден хранителните дневници се поддържаха отново и се получава празна проба от урина през първата сутрин на ден 7. Информирано съгласие беше получено от всички доброволци преди проучването и етичното одобрение от Етичния комитет на NHS Research, Брадфорд, Великобритания. .

Хранителни дневници

Хранителните дневници бяха напълно кодирани с помощта на вътрешен пакет за анализ на диетата, базиран на Microsoft Access, като се използва UK Food Composition (Holland et al., 1992). За да се оцени спазването на интервенцията, честотата на консумация на определени групи храни (хляб, сладкиши, зърнени закуски и тестени изделия) по време на нормалната диета (дни 1 и 2) е сравнена с тази на интервенцията (дни 5 и 6). Освен това бяха изчислени специфични тегла на храната и беше определен прием на храна на базата на пшеница за всеки индивид въз основа на основните източници на пшеница (хляб, зърнени закуски, рула, тестени изделия, сладкиши и бисквитки). Други източници на пшеница се срещат в храната, например в сосове и сгъстители. Приносът му за общия прием на пшеница обаче е оценен от относително незначително значение.

Екстракция на DON в урината

Общият DON на урината беше измерен, като се използва модификация на метода на Meky et al. (2003) и използването на 13 C-DON (Biopure Referenzsubstanzen, Tulln, Австрия) като IS. IS е смес, съдържаща предимно 13 C 15 -DON (молекулна маса (M r) 311; 81.4%), но също така 13 C 14 -DON (M 310); 16,8%). Пригодността на това съединение като IS наскоро беше установена в LC-MS/MS анализ на зърнени култури, замърсени с DON (Haubl et al., 2006).

При нашия анализ на урината пробите бяха центрофугирани (2000 g; 15 минути; 4 ° C) и IS беше добавен към 4 ml урина, за да се получи крайна концентрация от 5 ng/ml. РН на всяка проба се регулира на 6,8 и се добавят 23 000 U β-глюкуронидаза (Escherichia coli тип IX-A; Sigma) в 1 ml 75 mM KH 2 PO 4 и се инкубира на водна баня с разбъркване в продължение на 18 часа. при 37 ° С. След разграждане пробите се центрофугират (2000 g; 15 минути; 4 ° С) и супернатантата се разрежда до 16 ml с PBS (рН 7,2). Разреденият материал се прекарва през DONtest ​​имуноафинитетни колони (IAC) (Vicam, Watertown, MA, USA), за да се извлече DON съгласно инструкциите на производителя. DON се елуира от колоните с 4 ml метанол и екстрактите се сушат под вакуум с помощта на Savant Speed ​​Vac и се разтварят в 250 ul 10% (v/v) етанол за анализ. Две аликвотни части от проба от урина с известни нива на DON също бяха добавени към IS и анализирани с всяка партида от тестови проби като контрол на качеството (QC).

LC-MS анализ на извлечен DON

DON се анализира чрез HPLC (Waters 2795 Separation Module, Milford, MA, USA) с MS детекция (Micromass Quattro Micro троен квадруполен масспектрометър, Манчестър, Великобритания). Разделянето на DON беше постигнато с помощта на колона Luna C18 (150 × 4.6 mm, размер на частиците 5 μm (Phenomonex, Macclesfield, UK). Подвижната фаза беше стартирана с 20% метанол и беше проведена изократно за 10 минути. Една фаза на измиване за 6 минути ). след това се провежда мин с използване на 75% метанол, след което 20% метанол се въвежда отново с равновесието на системата при тази концентрация за още 11 минути. Скоростта на потока е 1 ml/min, а обемът на инжектиране е 25 ul. Елуентът от HPLC колоната се насочва към MS дезолвационната камера и остатъкът се изпраща в отпадъци.

M/z спектър на (a) немаркиран стандарт DON (200 ng/ml) и (b) IS стандарт (200 ng/ml).

Изображение в пълен размер

Обща йонна хроматограма на проба от урина, съдържаща 13,1 ng DON/ml урина, добавена с вътрешния стандарт 13 C-DON. H + следа (а), генерирана от SIR на Na + DON мониторингови маси от 297.2 (DON) и 319.2 (DON); Генерирана от SIR следа (b) от 13 C-DON проследяващи маси от 333,2 (13 C 14 -DON Na +) и 334,2 (13 C 15 -DON Na +). Времето на задържане на двете съединения е 7.4 минути.

Изображение в пълен размер

Анализ на креатинина

Концентрациите на креатинин бяха измервани във всички проби от урина, използвайки клиничния метод на Bayer на инструмент ADVIA Chemistry Systems 1650 (отдел по клинична биохимия, Leeds General Infirmary, Leeds, UK). Крайната концентрация на DON в ng/ml урина се коригира, използвайки данни за креатинин и се изразява като ng DON/mg креатинин.

Статистически анализ

Когато DON в урината не може да се измери количествено, т.е. под LOQ, при всички анализи се използва средна стойност между LOQ и нула. Концентрациите на DON в урината се превръщат в естествен log преди анализ. Сравненията между сдвоените данни бяха направени с помощта на t-тест на Student и беше приложен регресионен анализ за изследване на ефекта от възрастта, пола, антропометрията и приема на храна върху нивата на DON в урината както по време на консумация. Нормално, така както по време на интервенцията за намаляване на пшеницата (с помощта на STATA версия 7.0). Само по време на интервенционния период индивидите са разделени на потребители и непотребители на прием на храна на базата на пшеница и нива на DON в урината в сравнение между групите, използвайки регресионен анализ в STATA. За улесняване на представянето данните за пикочния ДОН бяха трансформирани отново и в таблици бяха използвани геометричните средни стойности и 95% доверителен интервал (CI).

Резултати

Данните от демографското проучване са представени в таблица 1. Има повече жени (n = 16), отколкото мъже (n = 9). Жените бяха по-ниски (P

За 25 индивида бяха получени сдвоени проби за измерване на дезоксиниваленол в урината. Излюпените ленти са за тези, които консумират нормалната си диета, а плътните черни ленти са за тези, които следват 4-дневната намеса за намаляване на пшеницата. За 16 индивида пробите, взети след интервенцията, са под границата на откриване.

Изображение в пълен размер

Ограниченият брой индивиди и относително еднаквата консумация на основните потенциални източници на DON във фазата на нормалното хранене на проучването ограничават задълбочен анализ на приноса на специфични храни към нивата на DON в урината. В сравнение с нормалния период на диета, нивата на DON за намеса в урината са намалени при 24 от 25 индивида. Имаше само едно лице, което не се съобрази с предложената намеса. По време на нормалната фаза на диета този индивид консумира пълнозърнест хляб (средно 131 г/ден) като основен източник на пшеница. За този човек пълнозърнестият хляб остава основният източник на пшеница по време на интервенцията и на 5 и 6 ден приемът действително се увеличава (средно 154 g/ден). Този човек беше единственият човек, за когото нивото на ДОН в урината се повиши, от 5,2 ng/mg на 3-ия ден до 12,6 ng/mg на 7-мия ден. Като цяло средното тегло на храни на основата на пшеница, консумирани по време на диетата, е нормално (326 g; диапазон: 40–665 g и 299 g; диапазон: 0–523 g на съответно 1 и 2 ден) е значително по-нисък (P 13 C-DON, тъй като IS допълнително подобрява надеждността на това проучване.

Фармакокинетиката на екскрецията на DON и неговите метаболити с урината не е установена. Изглежда обаче, че глюкуронидът се образува бързо при прасетата и има кинетика на серумен клирънс, подобна на тази на изходното съединение (Goyarts and Danicke, 2006). Фармакокинетиката на клирънс на DON както при прасета (Goyarts and Danicke, 2006), така и при плъхове (Meky et al., 2003) предполага, че 4 дни биха били достатъчни за отделяне на по-голямата част от погълнатия преди това DON, след като този микотоксин бъде изчистен от диетата. Намаляването на нивата в урината след нашето 4-дневно интервенционно проучване е в съответствие с прогнозираното за други пикочни биомаркери за микотоксини, където маркерът обикновено отразява експозицията през предходните 24-48 часа поради бързото отделяне (Groopman et al., 1992) .

Неотдавнашното проучване на SCOOP (2003 г.) в Европейския съюз подчерта замърсяването с DON на зърнени култури и зърнени продукти и предложи в някои случаи TDI да бъде надвишен в Обединеното кралство. Съществуват обаче много несигурности при установяване на излагането на човека на DON от анализа на храните и оценките на консумацията на зърнени култури. Първо, известна е хетерогенността на замърсяването с микотоксини на даден хранителен продукт, което затруднява вземането на представителни храни за анализ. Второ, експозицията зависи не само от замърсяването, но и от нивото на потребление. Това може да се определи от диетични проучвания, но може да не отчита адекватно крайностите на приема на индивидуално ниво или в определени подгрупи в дадена популация, например вегетарианци и кърмачета. Разработването на пикочен ДОН биомаркер обещава по-обективна мярка за експозиция на индивидуално ниво. Този подход е постигнат успешно с афлатоксини и е довел до забележителен напредък в разбирането на експозицията и свързаните със здравето ефекти (Wild и Turner, 2002).

Предвид очевидната обща експозиция и мощна токсичност, проявена от DON при животни (Pestka и Smolinski, 2005), е важно да се изследват възможните ефекти върху здравето от настоящите нива на експозиция при хората. Бебетата и децата се предвиждат да имат по-високи нива на прием в сравнение с възрастните и както при повечето токсични експозиции, много младите могат да бъдат особено податливи. Други високорискови групи могат да включват вегетарианци, които консумират особено високи нива на зърнени храни. Наличието на експозиционен биомаркер прави подобни проучвания реалистични за първи път.