фенотип

  • Субекти
  • Обобщение
  • Заден план:
  • Цел:
  • Методи:
  • Резултати:
  • Завършеност:
  • Въведение
  • материали и методи
  • Животни и диети
  • Орален толеранс към глюкоза, наддаване на тегло и тест за прием на храна
  • Колекция от тъкани
  • Експресия на хипоталамусен ген
  • Анализ на концентрацията на фолиева киселина
  • Глобален анализ на метилирането на ДНК на хипоталамуса
  • Статистически анализ
  • Резултати
  • Прием на храна, наддаване на тегло и реакция на глюкоза
  • Експресия на хипоталамусен ген
  • Състояние на фолиевата киселина
  • Глобален статус на метилиране
  • Дискусия

Субекти

  • Генната експресия
  • Хипоталамус
  • Хранителни добавки
  • Затлъстяване

Обобщение

Заден план:

Високо поливитаминните диети (10 пъти AIN-93G, HV), хранени по време на бременност с плъхове Wistar, увеличават характеристиките на метаболитния синдром при потомството, когато се отбият от препоръчаната витаминна диета (RV).

Цел:

За да се определи дали ефектите от гестационните HV диети върху обезогенните фенотипове при потомството възникват в резултат на променен хипоталамусен контрол върху поведението на хранене и дали повишеният им прием на храна може да бъде предотвратен чрез хранене с HV или високо съдържание на фолиева киселина (10 пъти фолат, HFol) диети

Методи:

Мъжки потомци на майки, хранени с HV диета по време на бременност, отбити от диети с RV, HV или HFol, са сравнени с тези, родени на язовири с RV и отбити от RV диета в продължение на 29 седмици. Приемът на храна за 72 часа и телесното тегло се измерват съответно на всеки две седмици и седмично. Отговорът на глюкозата към натоварване с глюкоза е измерен на 18 седмици след отбиването. Хипоталамусна генна експресия на свързани с храната невропептиди, включително невропептид Y, про-опиомеланокортин (POMC), инсулинов рецептор, лептинов рецептор, мозъчен невротрофичен фактор (BDNF), допаминови рецептори (DopaR1/2/5) и серотонин (SeroR1A/2A/2C), както и глобалното метилиране на ДНК и концентрациите на фолат в мозъка и плазмата са измерени на 29 седмици след отбиването.

Резултати:

Диетата на кученца HV или HFol повишава концентрациите на фолат в мозъка и плазмата и предотвратява увеличения прием на храна (5%, P = 0,03), телесното тегло (8%, P = 0,0006) и отговора на глюкозата към натоварване с глюкоза (36%, P = 0,02 ), открити при тези, хранени с диета с RV. Експресията на аноректичен POMC (P = 0,004) и BDNF (P = 0,02) е по-висока и DopaR1 е по-ниска (P = 0,06) при кученца, хранени с HV диета. Диетата за кученца HFol доведе BDNF частично до контролното ниво (P = 0,02) и намали SeroR2A (P = 0,008). Експресията на други гени не е засегната. Цялостното метилиране на ДНК е сходно между диетичните групи.

Завършеност:

Обезогенният фенотип в потомството на HV-хранена плячка се предотвратява чрез хранене на диети за кученца HV или HFol, вероятно поради модулация на регулаторните механизми на приема на храна след отбиването.

Въведение

материали и методи

Животни и диети

Схематична диаграма на изследването ( да се ) дизайн и ( б ) протокол за мъжко потомство от 0 до 29 седмици след отбиването. Съкращения на диетите: RV, диетата AIN-93G с препоръчани витамини; HV, 10 пъти препоръчаната мултивитаминна смес; HFol, RV + 10 пъти съдържанието на фолиева киселина. Диетите, консумирани по време на бременност, са посочени преди таблото. Диетите, консумирани от потомството, обозначени след тирето.

Изображение в пълен размер

Орален толеранс към глюкоза, наддаване на тегло и тест за прием на храна

Фигура 1b описва протокола за изследване. Приемът на храна за 72 часа се измерва на всеки 2 седмици от 0 до 29 седмици след отбиването. Телесното тегло се измерва при раждането и при отбиването, а наддаването на тегло се изчислява седмично от 0 до 29 седмици след отбиването. Отговорът на глюкозата към глюкозната сонда (0,375 g глюкоза на ml, 5 g глюкоза на kg телесно тегло) се измерва на 18 седмици след отбиването. Плъховете се гладуват цяла нощ в продължение на 10 часа преди измерване на глюкозата. Взема се кръвна проба от опашната вена и базалната глюкоза веднага се тества с помощта на търговски глюкомер (MediSense Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA). След измерване на глюкозата, концентрациите на глюкоза в кръвта се определят 15 и 60 минути по-късно и се изчислява допълнителната площ под кривата.

Колекция от тъкани

Целият мозък на плъхове бързо се отстранява след обезглавяване на 29 седмици след отбиването и веднага се замразява върху сух лед и след това се съхранява при -80 ° С. Мозъците се размразяват върху лед и дясната и лявата страна на хипоталамуса се дисектират отделно с помощта на метод, описан по-горе. 14 Оптичната хиазма се използва като демаркация на предната част на хипоталамуса. Това преминава през предната комисура, която е била използвана като хоризонтална граница. Линията между задния хипоталамус и телата на бозайниците се счита за каудален участък. Дисектираните хипоталамусни блокове съдържаха сложни преоптични, супраоптични, паравентрикуларни, предни, супрахиазматични, дорзомедиални, вентромедиални, дъговидни, бобовидни, задни и странични ядра. Дясната страна на хипоталамуса се използва за относителната експресия на гена, а лявата страна за статуса на метилиране на ДНК. Лявата страна на останалия мозък се използва за измерване на концентрацията на фолиева киселина. Събира се кръв от багажника и се центрофугира и се добавят плазмени проби с 0,5% аскорбинова киселина, за да се предотврати окисляването на фолиева киселина.

Експресия на хипоталамусен ген

Всеки дисектиран хипоталамус се хомогенизира, като се използва хомогенизатор за разкъсване на тъкани (Qiagen Tech., Mississauga, ON, Канада). РНК на хомогенизираните проби се изолира, като се използва реагент Trizol и се екстрахира с хлороформ съгласно протокола на производителя (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) и се определя количествено, като се използва Nanodrop 1000. cDNA се синтезира с помощта на комплект с cDNA архив в ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Gene Amp PCR System 2700.

RT-PCR в реално време се извършва на ABI PRISM 7000 система за откриване на последователност, използвайки анализи Taqman за следните гени, придобити от ABI: невропептид Y (Cat # Rn01410146_m1); про-опиомеланокортин (POMC; Cat # Rn00595020_m1); инсулинов рецептор (Cat # Rn00567070_m1); рецептор за лептин (Cat # Rn01433205_m1); мозъчен невротрофичен фактор (BDNF; Cat # Rn02531967_s1); допаминов рецептор 1 (DopaR1; Cat # Rn03062203_s1); допаминов рецептор 2 (DopaR2; Cat # Rn00561126_m1); допаминов рецептор 5 (DopaR5; Cat # Rn00562768_s1); серотонинов рецептор 1А (SeroR1A; Cat # Rn00561409_s1); серотонинов рецептор 2А (SeroR2A; Cat # Rn01468302_m1); серотонинов рецептор 2C (SeroR2C; Cat # Rn00562748_m1). Условията на цикъла бяха 50 ° С за 2 минути, 95 ° С за 10 минути, 40 цикъла за 95 ° С за 15 s и 60 ° C за 1 минута. Относителният метод за количествено определяне беше извършен като се използва глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (Cat # Rn99999916_s1) като ендогенен контрол, който беше избран въз основа на предварително изследване за най-ниската му вариация. Резултатите бяха изразени като кратна промяна по метода 2 ΔΔCT 15 и бяха анализирани с помощта на софтуера ABI DataAssist версия 3.0.

Анализ на концентрацията на фолиева киселина

Концентрациите на фолиева киселина в плазмата и мозъка се определят чрез микробиологичен микропланшетен анализ, използвайки Lactobacillus casei. 16, 17

Глобален анализ на метилирането на ДНК на хипоталамус

ДНК се изолира, използвайки протокола, описан от DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen Tech.). Две спектрофотометрични показания на ДНК пробите бяха осреднени за определяне на концентрацията, която имаше съотношение А 260 към А 280 между 1,8 и 2,0 и беше без замърсяване с РНК и протеини.

Общият статус на метилиране на хипоталамусната геномна ДНК се определя чрез метода на in vitro анализ за приемане на метил, както е описано по-горе. 18, 19 Този анализ включва 3Н-метил-S-аденозилметионин (New England Nuclear, Бостън, Масачузетс, САЩ) като медииран от Sss1 DNA метилтрансфераза донор на метил (New England Biolabs, Pickering, ON, Канада). Известно е, че приемливостта на метиловите групи в целия геном е обратно свързана с екзогенното включване на 3Н-метил. Всички проби бяха проведени в два екземпляра и пълният анализ беше проведен два пъти. Интра- и междуаналитичната CV е 5%.

Статистически анализ

Ефектите от лечението върху наддаването на тегло и 72-часовия прием на храна бяха анализирани, използвайки процедурата на PROC MIXED модел в SAS (Версия 9.2, SAS Institute Inc., Carey, NC, USA) с гестационни диети, диети за кученца и време като основни фактори. Средствата във всяка времева точка и за експресията на хипоталамусния ген, състоянието на фолиевата киселина и глюкозния отговор се сравняват чрез еднопосочен дисперсионен анализ, използвайки PROC GLM, последван от post-hoc тест на Tukey. Съществуват значителни разлики при P

Прием на храна за 72 часа мъжки потомци от 0 до 29 седмици след отбиването. Съкращения на диетите: RV, диетата AIN-93G с препоръчани витамини; HV, 10 пъти препоръчаната мултивитаминна смес; HFol, RV + 10 пъти съдържанието на фолиева киселина. Диетите, консумирани по време на бременност, са посочени преди таблото. Диетите, консумирани от потомството, обозначени след тирето. Диета (P = 0,03), време (P ab Значително различно според модела за повтарящи се мерки PROC MIXED. Стойностите са средни стойности ± sem, n = 12-14 за група.

Изображение в пълен размер

Телесно тегло на мъжкото потомство от 0 до 29 седмици след отбиването. Съкращения на диетите: RV, диетата AIN-93G с препоръчани витамини; HV, 10 пъти препоръчаната мултивитаминна смес; HFol, RV + 10 пъти съдържанието на фолиева киселина. Диетите, консумирани по време на бременност, са посочени преди таблото. Диетите, консумирани от потомството, обозначени след тирето. Наддаване на тегло: диета (P = 0,0006), време (P ab Значително различно според PROC MIXED модела за повтарящи се измервания. Стойностите са средни ± sem, n = 12-14 за група.

Изображение в пълен размер

Отговор на кръвната глюкоза към натоварване с глюкоза (5 g глюкоза на kg телесно тегло) като допълнителна площ под кривата (iAUC) на мъжкото потомство на 18 седмици след отбиването. Съкращения на диетите: RV, диетата AIN-93G с препоръчани витамини; HV, 10 пъти препоръчаната мултивитаминна смес; HFol, RV + 10 пъти съдържанието на фолиева киселина. Диетите, консумирани по време на бременност, са посочени преди таблото. Диетите, консумирани от потомството, обозначени след тирето. ab P = 0,02 чрез еднопосочен дисперсионен анализ, последван от post-hoc тест на Tukey. Стойностите са средни стойности ± sem, n = 8-12 на група.

Изображение в пълен размер

Експресия на хипоталамусен ген

Диетата на HV, но не и на HFol малки донесе POMC експресия за контрол на нивата при зрели потомци на HV майки (P = 0,004) (Фигура 5а). Диетата с HV кученца довежда експресията на BDNF до контролни нива, но диетата с кученца HFol само отслабва намаляването на експресията, причинено от гестационната диета на HV (P = 0,02) (Фигура 5а). Само диетата за кученца HFol намалява експресията на SeroR2A в сравнение с HV потомство, отбито от VR диета за кученца (P = 0,008) (Фигура 5b). Наблюдава се тенденция за по-ниска експресия на DopaR1 при HV потомство, отбито от HV диета за кученца в сравнение с RV потомство (P = 0,06) (Фигура 5b). Няма ефект от гестационните или кученските диети върху хипоталамусната експресия на други гени.

Хипоталамусна генна експресия на ( да се ) невропептид Y (NPY), про-опиомеланокортин (POMC), инсулинов рецептор (InsR), лептинов рецептор (LepR) и мозъчен невротрофичен фактор (BNDF) и ( б ) допаминови рецептори (DopaR1/R2/R5) и серотонинови рецептори (SeroR1A/2A/2C) при мъжки потомци на 29 седмици след отбиването. Съкращения на диетите: RV, диетата AIN-93G с препоръчани витамини; HV, 10 пъти препоръчаната мултивитаминна смес; HFol, RV + 10 пъти съдържанието на фолиева киселина. Диетите, консумирани по време на бременност, са посочени преди таблото. Диетите, консумирани от потомството, обозначени след тирето. ab Значително различен при еднопосочен дисперсионен анализ, последван от пост-хок теста на Tukey. Стойностите са средни стойности ± sem, n = 4-7 на група.

Изображение в пълен размер

Състояние на фолиевата киселина

Нивата на фолиева киселина в мозъка (Фигура 6а) и в плазмата (Фигура 6b) не са били засегнати от диетата на плячката, но са били повишени от диетата на кученцата HV или HFol.

Въпреки че е доказано, че фолатът е активен участник в реакциите на трансфер на метил, общото метилиране не е повлияно от гестационната диета или диетата след отбиването. Това обаче не е изненадващо, тъй като предишни проучвания съобщават за ДНК метилиране на гени при липса на откриваема промяна в общото метилиране, което предполага, че епигенетичните промени са специфични за мястото. 33 Освен това диетите с RV, HV и HFol в нашето проучване съдържат големи количества холин, което е друг фактор, който влияе върху метилирането на ДНК, 34, 35 и може само да закрие откриването на ефекта на фолат върху метилирането. Метаболизмът на холин и други витамини от метиловата група (т.е. фолат, витамин В6 и В12) е тясно свързан. 36

Значителна слабост на изследването възниква от липсата на измерване на генната експресия на различни етапи на зрялост. Следователно, ние не знаем етапа на зреене, когато диетите след отбиване променят хипоталамуса. В допълнение към хипоталамусните гени, измерването на гени в области на мозъка, участващи в награда и мотивация, може да е допринесло за по-пълно разбиране на цялостното въздействие на диетите върху регулирането на приема на храна. Доказано е, че мишките, хранени с диета с високо съдържание на мазнини след отбиването (60% от калориите от мазнини), имат намалена експресия на гена на μ-опиоидния рецептор, който влияе върху схемите за възнаграждение във вентралната тегментална област, ядрото. . 37

В заключение, обезогенният фенотип в потомството на HV-хранена плячка може да бъде следствие от променен хипоталамусен контрол на поведението при хранене, но може да бъде предотвратен чрез хранене на HV или HFol диети за кученца.