Субекти

Обобщение

Въведение

Тук изследваме влиянието на Cav върху ориентацията на липидния сал на каналите Kv1, като анализираме функцията на възможен консервиран CBD мотив в семейството Shaker. Както Kv1.3, така и Kv1.5 са насочени към липидни салове, но само Kv1.3 ефективно взаимодейства с Cav чрез CBD, където тази асоциация е от съществено значение за локализацията на каналите в тези домейни. Освен това поведението и активността на Kv1.3 бяха обусловени от присъствието на Cav1. Следователно, наличието на CBD близо до T1 на Kv1.3 има важни функционални последици за физиологията на канала Kv1.3.

Резултати

Диференциална кавеолинова зависимост на Kv1.3 и Kv1.5 разделяне на липидни салове

правила

Общо протеиновите лизати на HEK Cav1, получени 24 часа след трансфекция с посочения канал (маркиран с YFP), се имунопреципитират срещу кавеолин. Проби, разделени чрез SDS-PAGE и имуноблотирани (IB) срещу GFP (канал) и антитела срещу кавеолин. ( ДА СЕ ) Схематични диаграми на пресечени канали Kv1.3 и химери Kv1.3-Kv1.5. Kv1.3 домейни: бели варели и черни линии. Kv1.5 домейни: сиви бъчви и сиви линии. ( Б. ) Изходни материали. Горният панел, филтрите бяха имуноблотирани срещу GFP (Канали). Долен панел, филтри бяха тествани срещу Cav, за да се демонстрира Cav имунопреципитация. ( ° С ) Имунопреципитати. Не се наблюдава имунопреципитация при липса на антитяло (IP-).

Изображение в пълен размер

Кавеолин 1 взаимодейства с Kv1.3 чрез CBD подпис, разположен в N терминала на канала

Изолирани липидни салове, направени в HEK Cav- (леви панели) и HEK Cav1 (десни панели), изразяващи Kv1.3CBD ( ДА СЕ ) и мутантни Kv1.5CBD канали ( Б. ) (166 FQRQVWLLF 174 до AQRQVGLLA и 232 FQRQVWLIF 240 до AQRQVWLIF 240 до AQRQVWLIF 240). ( ° С ) HEK Cav1, експресиращ Kv1.3 или Kv1.3CBD, се имунопреципитира срещу кавеолин (IP: Cav1) в присъствието (+) и отсъствието (-) на кавеолиново антитяло. Пробите се разделят чрез SDS-PAGE и се имуноблотират срещу Kv1.3 (IB: Kv1.3) и кавеолин (IB: Caveolin) SM: изходен материал; SN: супернатант; PI: имунопреципитат.

Изображение в пълен размер

Не открихме взаимодействия между Kv1.5 и Cav1; обаче, когато конвертираме предполагаемата Kv1.5 CBD в тази на Kv1.3 (Kv1.5I239L), наблюдаваме положителна Cav1 ко-имунопреципитация Фиг. S4. Освен това, доказателствата сочат, че Kv1.5 би могъл индиректно да взаимодейства с кавеолини чрез образуването на супрамолекулни комплекси, включително SAP97 33, 34. SAP97 (свързаният със синапс протеин 97) е член на семейството на мембранно-асоциираната гуанилат киназа (MAGUK), което включва и PSD95 (протеин на постсинаптичната плътност 95). Следователно, ние експресираме Kv1.5 в присъствието и отсъствието на PSD95 в HEK Cav1 клетки. В този сценарий Kv1.5 се ко-имунопреципитира с Cav1, само в присъствието на PSD95 (фиг. S4). Следователно, нашите данни показват, че докато пълната цялост на Kv1.3 CBD е достатъчна за взаимодействие с Cav1, Kv1.5 изисква помощни протеини.

Дискусия

Доказателствата показват, че Kv1.3 е насочен към специфични мембранни места 35, 36, а изместванията на местоположението имат патологични последствия 37. Нашето проучване подчертава основния механизъм на разделяне на мембранната повърхност на канала Kv1.3. Тук докладваме, че сред каналите Kv1 (Shaker) само Kv1.3 и Kv1.5 са насочени значително към липидни салове. Въпреки това, докато Kv1.5 плаваемостта е независима от експресията на кавеолин, концентрацията на Kv1.3 липидни салове се увеличава по зависим от дозата кавеолин начин. Това има физиологично значение, тъй като е потвърдено при BMDM от Cav1 -/- мишки. Освен това колокализацията на кавеолиновия канал е по-висока с Kv1.3, отколкото с Kv1.5. И накрая, ясно идентифицирахме CBD, който се намира в N-терминалния домейн на Kv1.3 и е елементът, отговорен за взаимодействието Cav1 и местоположението на липидния сал на канала. Тъй като ориентацията на липидните салове е предложена като механизъм за регулиране на йонните канали, 1, 38 нашите резултати допринасят за това разширяващо се поле.

В обобщение, нашите резултати помагат да се изяснят механизмите, които насочват Kv1 каналите към специфични повърхностни микродомейни, които участват в фина настройка на клетъчните реакции. За разлика от други Kv1 невронални канали, Kv1.3 взаимодейства с кавеолин чрез CBD, разположен в N-терминалния домейн на канала, съседен на първия трансмембранен сегмент и в непосредствена близост до T1 домена и мястото на свързване на Kvβ. Тази асоциация насочва Kv1.3 към кавеоларни структури, които регулират както динамиката, така и активността на мембраната на канала.

Методи

Експресионни плазмиди и насочена към сайта мутагенеза.

Плъх Kv1.3 в pRcCMV е осигурен от TC Holmes (Калифорнийски университет, Ървайн, Калифорния). Плъх Kv1.1 и Kv1.4 в pGEM7 и човешки Kv1.5 в pBK конструкции бяха субклонирани в pEYFP-C1 и pECerulean-C1 (Clontech). Химерите Kv1.3/Kv1.5 бяха генерирани в каналите pEYFP-rKv1.3 и pEYFP-hKv1.5 чрез вмъкване на сайтовете BglII и EcoRI в N и C домейните на терминала на каналите. Мутантите бяха генерирани с помощта на комплекти за мутагенеза, насочени към сайта QuikChange (Stratagene). LoopBAD последователността (BAD, приемник на биотин домен) беше вмъкната в първия извънклетъчен цикъл на pEYFP-Kv1.3 в рамките на съществуващ NruI сайт за конструкцията rKv1.3LoopBAD. E. coli Биотин лигаза, съдържаща конструкцията pBtac_BirA, беше използвана, както е описано по-рано 54. Плъх Cav 1 в pECerulean-C1 е предоставен от JR Martens (Медицински факултет на Университета на Флорида). Cav1 се вкарва в pcDNA3 чрез смилане на Cav-pECerulean (HindIII-BamHI). Конструкциите бяха проверени чрез секвениране.

Клетъчна култура, преходни трансфекции и изолиране на салове.

HEK 293 клетки се отглеждат в DMEM, съдържащ 10% FBS и 100 U/ml пеницилин/стрептомицин (Gibco). Преходна трансфекция се извършва с Metafectene ™ Pro (Biontex) при почти 80% сливане. Макрофаги, получени от миши костен мозък, са изолирани, както е описано по-горе [55]. Всички експерименти и хирургични протоколи са извършени в съответствие с насоките, одобрени от комитета по етика на Университета в Барселона в съответствие с Директива 86/609 CEE на Съвета на Европейската общност.

Изолирани са неразтворими в тритон комплекси с ниска плътност, както е описано по-рано 18, 20. Клетките се хомогенизират в 1 ml 1% Triton X-100 и се добавя захароза до крайна концентрация 40%. Линеен градиент на захароза от 5 до 30% беше поставен отгоре и допълнително центрофугиран (39 000 об/мин) в продължение на 20 до 22 часа при 4 ° С в ротор на Beckman SW41. Градиентни фракции (1 ml) бяха събрани отгоре и анализирани чрез Western blotting.

Екстракция на протеини, ко-имунопреципитация и Western blot анализ.

Клетките, измити в студен PBS, бяха лизирани върху лед с NHG разтвор (1% Triton X-100, 10% глицерол, 50 mmol/L HEPES pH 7.2, 150 mmol/L NaCl), допълнени с 1 μg/ml апротинин, 1 µg/ml левпептин, 1 µg/ml пепстатин и 1 mM фенилметилсулфонил флуорид за инхибиране на протеази. Хомогенатите се центрофугират при 16 000 х g в продължение на 15 минути и съдържанието на протеин се измерва с помощта на Bio-Rad протеинов анализ.

За имунопреципитация пробите бяха предварително изчистени с 30 µl протеинови А-сефарозни зърна в продължение на 2 часа при 4 ° С с леко смесване като част от процедурите за ко-имунопреципитация. След това зърната се отстраняват чрез центрофугиране при 1000 х g за 30 s при 4 ° С. Пробите се инкубират цяла нощ с анти-кавеолиновото антитяло (4 ng/µg протеин) при 4 ° С с леко разклащане. Тридесет микролитра протеин А-сефароза бяха добавени към всяка проба и инкубирани в продължение на 4 часа при 4 ° С. Зърната бяха отстранени чрез центрофугиране при 1000 xg за 30 s при 4 ° C, промити четири пъти в NHG и ресуспендирани в 100 μl Laemmli SDS буфер.

Протеинови проби (50 ug), сални фракции (50 ul) и имунопреципитати се варят в зареждащия буфер на Laemmli SDS и се разделят с 10% SDS-PAGE. След това пробите бяха прехвърлени в PVDF мембрани (Immobilon-P, Millipore) и блокирани с 5% Tween 20 PBS, допълнени с 5% мляко на прах. След това филтрите бяха имуноблотирани със специфични антитела: анти-GFP (1/1000, Roche), антикавеолин (1/2, 500, BD Biosciences), анти-Kv1.3 (1/500, Neuromab), антиклатрин (1/1 000, BD Biosciences), анти-флотилин (1/1 000, BD Biosciences). Накрая, филтрите се промиват с 0,05% Tween 20 PBS и се инкубират с вторични антитела, конюгирани с хрянова пероксидаза (BioRad).

Имуноцитохимия, плазмен мембранен торф (PML) и трансмисионна електронна микроскопия.

HEK клетки, засяти върху третирани с поли-D-лизин покривни стъкла, бяха използвани 24 часа след трансфекцията (Metafectene Pro). Клетките се промиват в PBS (безфосфатен буфериран физиологичен разтвор) и се фиксират с 4% параформалдехид за 10 минути при стайна температура (RT). За да се открие Cav 1, клетките бяха пермеабилизирани, използвайки 0.1% Triton X-100 за 10 минути. След 60 минути в блокиращ разтвор (10% кози серум (Gibco), 5% обезмаслено сухо мляко, PBS), клетките бяха третирани със заешко анти-кавеолиново антитяло (1/100, BD Biosciences) в 10% кози серум. 0,05% Triton X-100 и се инкубира отново за 1 час. След 3 промивания препаратите се инкубират в продължение на 45 минути с конюгираното антитяло Alexa-Fluor-555 (1: 500; Молекулярни сонди), промиват се и се монтират в Mowiol (Calbiochem). Всички процедури са извършени в RT.

Препаратите от ПМЛ са получени чрез осмотичен шок с малки модификации 29. Накратко, клетките бяха охладени върху лед за 5 минути и измити два пъти в PBS. След това клетките се инкубират за 5 минути в 1/3 KHMgE (70 mM KCI, 30 mM HEPES, 5 mM MgCl2, 3 mM EGTA, рН 7.5) и внимателно се измиват с неразреден KHMgE, за да се предизвика хипотоничен шок. Счупените клетки бяха отстранени от покривалото чрез пипетиране нагоре и надолу. След две измивания с буфер KHMgE, останаха само мембранни листове. PML се фиксират с пресен 4% параформалдехид за 10 минути при стайна температура и се монтират в монтажна среда Mowiol.

За трансмисионна електронна микроскопия PML се третират, както се извършва за имуноцитохимия, но се визуализират с различни вторични антитела. Kv1.3 се разпознава от миши анти-Kv1.3 антитяло (1/20, Neuromab). Кози анти-миши и заешки антитела, конюгирани до 10 nm и 15 nm златни частици, разпознават Kv1.3 и Cav1, съответно. Накратко, обработените проби бяха допълнително фиксирани с 2.5% глутаралдехид в PBS за 30 минути при стайна температура. След това пробите бяха лиофилизирани, измити и криозащитени с 10% метанол. След това пробите бяха подложени на криогенно бързо замразяване (BAF-060, Bal-Tec) в продължение на 90 минути при -90 ° C и налягане 10–7 mbar. Репликите са получени чрез въртене (136 rpm), изпаряване на платина от 1 nm през електронно оръдие (под ъгъл 23 °). Това беше подсилено чрез изпаряване на 10 nm въглерод (под ъгъл от 75 °). Репликите се отделят от пробата, като се използва 30% флуороводородна киселина. Накрая пробите бяха измити и монтирани на стелажи, покрити с Formvar.

Резонансен трансфер на енергия на Föster (FRET)

FRET се извършва в акцепторната конфигурация за избелване. Снимките са направени с конфокален микроскоп Leica SP2. Изображенията бяха получени преди и след YFP избелващото средство с 63 × маслена иммерсионна цел при увеличение 4. Възбуждането беше извършено през 458 и 514 nm линии на Ar лазера, а емисионните филтри бяха използвани лентови 473–495 и 535–583. FRET ефективността (FRETeff) се изчислява, като се използва уравнението:

където, F D след: донорен флуоресцентен (Cerulean) след и F D преди акцепторен белина (YFP). Анализът беше извършен с помощта на ImageJ.

Възстановяване на флуоресценцията след фотоелектрично избелване (FRAP) и проследяване на отделни частици (SPT)

Експериментите са проведени, както е описано по-рано 46, 54, 56. За експериментите с FRAP се използва микроскоп Olympus FV1000. Накратко, YFP се избелва в продължение на 250 ms с 30% 515nm Ar лазер и се наблюдава флуоресценция преди и след избелването с маслена обектива PLAPO 60x NA 1: 1, 40 с увеличение 4, придобиващо на всеки 108 s. Придобиването е направено с 1% 515nm Ar лазерна линия и 525–560nm лентов емисионен филтър.

Електрофизиология

Бяха проведени експерименти за настройка на пергаментни скоби за цели клетки, както беше направено в 49. За да предизвикат зависими от напрежението токове, клетките бяха стимулирани с квадратни импулси от 250 ms, вариращи от -60 до +80 mV на стъпки от 10 mV. Инактивирането на тип С беше изследвано чрез прилагане на дълъг импулс от 5 s при +60 mV. Пиковата амплитуда (pA) се нормализира, като се използват стойностите на капацитета (pF). Анализът на данните беше извършен със софтуера FitMaster (HEKA) и Sigma Plot 10.0 (Systat Software). Всички записи са направени в RT.