• Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Дискусия
  • Методи
  • приготвяне на пробата
  • Лабораторна настройка
  • Обработка на данни (лабораторна настройка)
  • Конфигурация ID19 (ESRF)
  • Обработка на данни (ID19)
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Видеоклипове
  • Допълнително видео 1
  • Допълнително видео 2
  • Коментари

Субекти

Обобщение

Въведение

Тук представяме фазова контрастна томография, базирана на размножаване, в оптимизирана комбинация от лабораторен източник на струя течен метал 20, инструментариум, подготовка на проби и алгоритъм за реконструкция, за да изобрази големи обеми мозъчна тъкан на мишка. Можем да покажем, че в рамките на реконструирания обем може да се постигне висок контраст без етикетиране и че в рамките на област от интерес (ROI) могат да се визуализират отделни неврони. Това дава достъп до непокътнатата 3D цитоархитектура на мозъка.

мозъка

В нашата нова техника за подготовка на проби ние поставяме тъканта в ксилол след дехидратация в етанол, подобно на конвенционалните протоколи за вграждане в парафин. Като решаваща и нова стъпка пропускаме всякакви допълнителни процедури за включване или контрастиране и измерваме пробата след изпаряване на органичния разтворител. За разлика от оцветяването с елементи с високо съдържание на Z, тази техника, която наричаме EOS подготовка (изпаряване на органичен разтворител), значително намалява абсорбцията поради отстраняването на вода и липиди, като същевременно генерира нов контраст между протеиновата матрица. Околната тъкан и въздуха.

Реконструкцията започва с фазово възстановяване на прожекционните изображения, записани за всеки ъгъл θ на томографско сканиране. За обекти с бавно променяща се абсорбция при малки разстояния на разпространение z зад обекта, разпределението на интензитета може да бъде изразено чрез приблизителна форма на уравнението за пренос на интензитета 21

където I 0, θ ( r ⊥) и ϕ θ ( r ⊥) обозначават интензивността и фазовото разпределение непосредствено зад обекта и

където беше заменен от α γ-зависимия параметър на регуларизация. Установихме, че този подход за реконструкция, предложен от Witte et al. и известна като корекция с помощта на Бронников (BAC) 22, тя предлага превъзходни резултати за текущите неоцветени тъкани и използваната микрофокусна CT конфигурация 23. Следователно, той се използва като алгоритъм по подразбиране в настоящата работа (фиг. 1г, д). След прилагане на алгоритъма за възстановяване на фаза във всяка проекция на томографското сканиране, 3D реконструкцията се извършва с филтрирана задна проекция (конусен лъч) 24. Имайте предвид, че контрастът на реконструирания обект трябва да се разглежда като ефективно количество, първо, тъй като както абсорбцията, така и фазовото взаимодействие допринасят за неговите стойности, и второ, тъй като поради съображения за потока КТ на лабораторията обикновено използва широколентова радиация за разлика от синхротронната КТ.

Изображение в пълен размер

Ние демонстрираме възможностите на лабораторната обстановка, като изобразяваме различни региони от интерес в мозъка на мишки от див тип.

Резултати

Комбинация от режими на изобразяване на конусен лъч и обратна геометрия (да се) Представяне на обема на дясното полукълбо на мозъка на мишка, записано в геометрия на конусен лъч. Сивите равнини показват позицията на разрезите, показани в ( б, ° С ). (б, в) Коронален/хоризонтален разрез през реконструирания обем. (д) Реконструиран коронарен разрез на хипокампалната област с клетъчна резолюция, записан в обратна геометрия. Позицията на измерването с висока разделителна способност спрямо общия обем на пробата е посочена в ( б ). Преди томографска реконструкция индивидуалните изгледи бяха преизбрани с коефициент 2. (и) Проекция с максимален интензитет от 31 последователни среза, имитиращи хистологичен разрез с дебелина 30 μm. (F) Реконструиран хоризонтален разрез на кортикалната област. (ж) Прожекция с максимален интензитет от 31 среза. Видими кортикални характеристики като полето на цевта са ясно видими. Мащабни ленти: ( б, ° С ) 500 μm, ( d - g ) 200 μm.

Изображение в пълен размер

Обем, спускащ се до клетъчното ниво на мишка на малкия мозък (да се) Напречно сечение през реконструирания обем, показващо молекулярния слой (ML), гранулирания слой (GL), бялото вещество (WM) и клетъчния слой на Purkinje (PCL) на малкия мозък в разрешаване на клетките. Преди томографска реконструкция индивидуалните изгледи бяха преизбрани с коефициент 2. б) Надлъжен разрез през обема показва достатъчно контраст, за да се идентифицират снопчетата от аксони в бялото вещество. (° С) Автоматично представяне на обема на пробата с парче в обема, показващо позицията на клетъчната сегментация, показана в ( д ). (д) Клетъчно сегментиране на малка част от пробата. Скала: 200 μm.

Изображение в пълен размер

Като отправна точка и за сравнение, ние също така извършихме измервания на подобна проба при лъч ID19 на ESRF в Гренобъл (допълнителна фигура S4, таблица S1 и видео 2). Сравнението на реконструираните обеми предполага, че въпреки по-ниската яркост на лабораторната настройка, както и дългите времена на експозиция, те са със сравнимо качество и разделителна способност, като и двете показват клетъчни детайли в обеми от mm.

Дискусия

Тази нова форма на виртуална 3D хистология избягва недостатъците на класическата хистология, като отнемаща време и инвазивна подготовка на пробата или механични изкривявания, дължащи се на процедурата на рязане, и осигурява виртуални хистологични сечения с всяка желана ориентация и дебелина. Най-важното е, че структурният анализ може да се извърши в 3D вместо в 2D, което позволява да се обърне внимание на проблемите на невронната свързаност и количествения геометричен анализ.

Класическото хистологично оцветяване на серийни разрези все още формира основата за анализ на мозъчната структура в голям брой изследвания, занимаващи се с фенотипиране на мутантни мишки или експериментално индуцирани патологични промени в модели на гризачи на мозъчно заболяване. В сравнение с 3D оптичните техники, нашият подход предлага предимства с оглед на изследванията с висока производителност, тъй като не изисква оцветяване или етикетиране на клетки, което отнема много време при подготовката на пробата. Освен това ограничителният фактор на относително дългите времена на сканиране в настоящия ни протокол вероятно ще бъде преодолян в бъдеще, тъй като добро съотношение сигнал/шум вече може да бъде постигнато с по-кратки времена на експозиция (вж. Допълнителна фигура S5) и различни подобрения Очаква се технологията с течни анодни аноди да доведе до значително увеличение на яркостта на източника. Освен това, ако е налично време на лъча, могат да се извършват експерименти на синхротрон, позволявайки бързи изображения на проби с малко по-висок контраст и разделителна способност.

Имайте предвид, че начинът, по който постигаме висока разделителна способност и контраст, предполага, както по отношение на подготовката на тъканите, така и на основната физика, че могат да бъдат разработени протоколи за изследване на 3D архитектурата на цито и фибри в човешкия мозък. Ниската абсорбция на препарата значително улеснява измерванията на големи проби.

Възможността за постигане на висока разделителна способност и контраст с лабораторни източници прави нашия метод приложим за широк спектър от биомедицински изследвания, които изискват по-голяма достъпност и ефективност.

Методи

приготвяне на пробата

По време на разработването на протокол, мозъците, които не се използват за CT експерименти, понякога се съхраняват в продължение на няколко седмици в етанол. Не забелязахме никаква промяна в поведението на сушене или макроскопска морфология. Някои от тези мозъци бяха рехидратирани (допълнителна фигура S6). Времето за рехидратация може да зависи от времето за съхранение в различните разтвори и в сухо състояние. Това не беше систематично тествано.

Не са наблюдавани промени в грубия или контрастен външен вид при изсушаване на цели мозъци в сравнение с по-малки части на мозъка. Приготвянето на проби с малък размер, подходящи за монтиране върху държачи на CT обекти, беше по-лесно, когато пробите бяха приготвени преди изсушаване. Също така отбелязваме, че цялата процедура е приложима за големи проби (например цели тела на мишката като най-голямата тествана проба). Изпарението на ксилол причинява свиване на тъканта, но не променя общата морфология (Допълнителна фигура S6).

Лабораторна настройка

Скица на общата лабораторна настройка е показана на фиг. 1. Източникът на течна метална струя (Excillum, Стокхолм, Швеция) се състои от Galinstan (68,5% Ga, 21,5% In и 10% Sn) с характерната енергия на фотоните 9,25 keV (Ga-K α). За експериментите той работи при напрежение в тръбата от 40 kV и електроните се фокусират до размер 10 × 40 µm 2, което води до приблизителен размер на фокусна точка 10 × 10 µm 2. Пробата се поставя в кула за проби с три транслационни оси и една въртяща се ос за томографски измервания. Освен това, два транслации, успоредни и перпендикулярни на лъча, позволяват позиционирането на оста на въртене по отношение на оптичната ос. За да се подравнят ъгълът на наклона и нулевата позиция на оста на въртене, детекторът се поставя на платформа с две транслации, перпендикулярни на оптичната ос.

В обратна геометрия в настройката беше въведена базираната на сцинтилатор камера XSight (Ригаку, Токио, Япония). Състои се от тънък монокристален сцинтилатор, 10-кратно увеличение и 2504 × 3326 пиксела CCD чип с получен размер на пикселите от 0,54 μm. За експериментите с геометрия на конусни лъчи беше инсталиран плосък панелен CMOS детектор с GinOS: Tb ​​сцинтилационен екран (PerkinElmer, Waltham, USA). Състои се от 1536 × 1944 пиксела с размер на пикселите 74,8 μm. Геометричните и експериментални параметри за измерванията са изброени в допълнителния раздел. S2

Обработка на данни (лабораторна настройка)

Възстановяването на фазата се извършва с BAC алгоритъм за всички записани проекции, като се използват параметрите, изброени в допълнителна таблица S2. Преди реконструкцията на 3D обема, алгоритъм за извличане на пръстени, базиран на вейвлет, беше приложен към синограмите 29. 3D реконструкцията на обема е получена със софтуера за реконструкция UltraFast ConeBeam (алгоритми Bronnikov, Arnhem, Холандия). Визуализацията на данните беше извършена с Avizo (FEI Visualization Sciences Group, Бърлингтън, САЩ). Кодът на розовия цвят е избран така, че виртуалните секции да приличат на хистологични секции, оцветени с хематоксилин и еозин (H&E оцветяване). Сегментирането на отделни клетки от пуркине се извършва ръчно за малка част от набора от данни, докато полуавтоматизиран подход е използван за маркиране на клетки в молекулярния и гранулирания слой. Тук клетките бяха обозначени с инструмент за четка, базиран на праг, който в рамките на региона, избран ръчно от потребителя, маркира само пиксели със сива стойност в определен диапазон.

Конфигурация ID19 (ESRF)

Експериментите са проведени на лъча ID19 (ESRF, Гренобъл, Франция) с паралелна геометрия на лъча. Пробата се поставя приблизително на 145 m зад инвертора в кула за проби с три оси на преместване и една ос на въртене, докато позицията на оста на въртене може да се регулира чрез две допълнителни транслации. Енергията на настройката е променлива и за този експеримент е избрана 18,685 keV с поток от

Обработка на данни (ID19)