имунопротеазомна

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • LMP7-дефицитните мишки са устойчиви на HFD-индуцирано затлъстяване
  • LMP7-дефицитните мишки са устойчиви на HFD-индуцирани метаболитни нарушения
  • Дефицитът на LMP7 няма ефект върху приема на храна, двигателната активност и разхода на енергия.
  • Дефицитът на LMP7 намалява липидната абсорбция
  • LMP7 в клетките на костния мозък и не-костния мозък допринася за развитието на затлъстяване.
  • Дефицитът на LMP7 отслабва възпалителните реакции в мастните тъкани.
  • Дискусия
  • Методи
  • Животни
  • Микро-КТ анализ
  • Биохимичен тест
  • GTT и ITT
  • Хистология и имунохистохимия.
  • RT-PCR анализ в реално време
  • BMT експерименти
  • Дихателни газове и двигателен анализ
  • Събиране на изпражнения и екстракция на липидни изпражнения
  • Анализ на поточната цитометрия
  • Експерименти инвитро
  • статистически анализ
  • Допълнителна информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

Субекти

  • Ендокринна система и метаболитни заболявания.
  • Метаболитен синдром
  • Затлъстяване

Обобщение

Въведение

Затлъстяването е основен рисков фактор за инсулинова резистентност, хипергликемия, дислипидемия и хипертония, известно като метаболитен синдром и се е превърнало в глобален проблем на общественото здраве. Тези метаболитни нарушения увеличават риска от сърдечно-съдови заболявания и захарен диабет тип 2 и допринасят за повишена смъртност и заболеваемост. Въпреки че патогенезата на затлъстяването е сложна и включва няколко фактора, скорошни проучвания разкриват, че възпалението в мастната тъкан е ключов патогенен играч 1, 2. Всъщност инфилтрация на макрофаги в мастната тъкан се наблюдава при животински модели на затлъстяване, както и при затлъстели хора с метаболитен синдром. Тези клетки са основният източник за производството на възпалителни цитокини/хемокини, включително тумор некротизиращ фактор α (TNF-α), интерлевкин (IL) -1β и CC мотив хемокинов лиганд 2 (CCL2, известен също като протеинов моноцитен хемоаттрактант 1 [ MCP-1]), който от своя страна набира възпалителни клетки и допълнително насърчава възпалението на мастната тъкан. Как обаче възниква и се регулира възпалението в патофизиологията на затлъстяването, не е напълно изяснено.

Резултати

LMP7-дефицитните мишки са устойчиви на HFD-индуцирано затлъстяване

Първо изследвахме дали дефицитът на LMP7 може да повлияе на развитието на затлъстяване, използвайки мишки от див тип (WT) и LMP7 -/-, хранени с нормална храна или HFD в продължение на 8 седмици. Въпреки че не е имало значителна разлика в наддаването на телесно тегло между WT и LMP7 -/- мишки при нормална диета за хранене, LMP7 -/- мишките са спечелили значително по-малко телесно тегло от WT мишките при диета с висока диета. 1А). Масата на епидидимална и подкожна бяла мастна тъкан (WAT) намалява драстично при LMP7 -/- мишки, в сравнение с тази на WT мишки (Фиг. 1В). Относителното тегло (тегло на тъканите/телесно тегло) на всеки WAT в LMP7 -/- мишки е по-ниско от това на WT мишки (Фиг. 1C, черен дроб: 15,9% намаление, епидидимално: 44,7%, мезентериално: 24,9%, периренално: 50,7 % и подкожно: 47,3%). Намаляването се дължи хистологично на намаляването на размера на адипоцитите в епидидималната и подкожната WAT (фиг. 1D, E). Анализът с компютърна томография (CT) показва по-ниска висцерална и подкожна мастна маса при LMP7 -/- мишки, отколкото при WT мишки (Фиг. 1F, G). Тези открития показват, че дефицитът на LMP7 предпазва от затлъстяване, предизвикано от HFD.

( A - C ) TCHO нива, TG ( ДА СЕ ), Кръвна захар ( Б. ) и серумен инсулин ( ° С ) в серум в WT и LMP7 -/- мишки в нормална храна и HFD (n = 8–12). ( НА ) GTT резултати ( д ) и ITT ( И ) при WT и LMP7 -/- мишки в нормална храна и HFD (n = 8 за всяка). Данните са изразени като средна стойност ± SEM. * p -/- в нормална храна или HFD (Фиг. 3А), ние измерихме двигателната активност и енергийните разходи в двата щама, за да оценим разликите в основния метаболизъм. Няма значителни разлики в двигателната активност, консумацията на кислород (VO 2), съотношението на дихателния обмен (RER), консумацията на въглехидрати (CH) и консумацията на мазнини (FAT) между WT и LMP7 -/мишки - при нормално хранене или при HFD хранене. (Фиг. 3B, C). В подкрепа на този резултат, въпреки че експресията на Ucp1 (разединяващ протеин 1 или термогенин) се увеличава в кафява мастна тъкан чрез HFD хранене, няма значителни разлики в експресията му между WT и LMP7 -/- мишки (данните не са показани).

( ДА СЕ ) Прием на храна при WT и LMP7 -/- мишки в нормална храна (n = 7–8) и HFD (n = 13–14). ( Б. ) Локомоторна активност при WT и LMP7 -/- мишки при нормално хранене и HFD (n = 8 за всяка). ( ° С ) Данни за енергийните разходи. VO 2, RER, CH и FAT в WT и LMP7 -/- мишки в нормална диета и HFD (n = 8 за всяка). Данните са изразени като средна стойност ± SEM.

Изображение в пълен размер

Дефицитът на LMP7 намалява липидната абсорбция

Дискусия

Основните констатации от това проучване са, както следва: (1) Дефицитът на LMP7 намалява натрупването на мазнини, предизвикано от HFD, и предпазва от затлъстяване; (2) Дефицитът на LMP7 подобрява непоносимостта към глюкоза и чувствителността към инсулин и подобрява метаболизма на липидите и глюкозата (3) няма разлики в приема на храна, двигателната активност и енергийните разходи между WT и LMP7 -/- мишки; (4) Дефицитът на LMP7 намалява абсорбцията на липиди; (5) Експериментите с BMT показват, че LMP7 в клетки, получени от костен мозък, а не получени от костен мозък, допринася за развитието на HFD-индуцирано затлъстяване; (6) Дефицитът на LMP намалява възпалителните реакции, като инфилтрация на макрофаги и експресия на хемокини, като същевременно увеличава производството на адипонекция. Резултатите от настоящото проучване показват, че LMP7 допринася за възпалителни реакции, задвижвани от макрофаги в мастната тъкан, и за развитието на затлъстяване и метаболитни нарушения. Доколкото ни е известно, това проучване предоставя първите доказателства, че LMP7 играе важна роля в развитието на затлъстяване и метаболитни нарушения.

Все повече доказателства показват, че възпалението играе важна роля за развитието на затлъстяване и метаболитни нарушения 1, 2. Въпреки че има редица доклади, които описват ролята на възпалението в неговия процес, не е напълно разбрано как възниква и се регулира възпалението. Въпреки че е известно, че имунопротеазомата играе съществена роля в представянето на MHC антигени от клас I, неотдавнашни изследвания показват, че LMP7 е необходим за продуциране на противовъзпалителни цитокини, като TNF-α и IL-6, и за напредък в експерименталния артрит и колит 5, 6. В настоящото проучване ние демонстрираме, че дефицитът на LMP7 инхибира възпалението на мастната тъкан, затлъстяването и метаболитните нарушения: това предполага, че инхибирането на LMP7 има потенциал за профилактика и лечение на затлъстяване и метаболитни нарушения. Всъщност няколко експериментални проучвания съобщават, че селективният LMP7 инхибитор ONX-0914 е значително ефективен при лечението на експериментален артрит и колит 5, 6. Следователно, ефектът на този инхибитор на LMP7 върху затлъстяването и метаболитните нарушения остава да бъде изследван в бъдещи проучвания.

Ние показваме, че дефицитът на LMP7 намалява експресията на панкреатичната липаза, повишава съдържанието на липиди във фекалиите и инхибира увеличаването на плазмените нива на TG след перорално приложение на масло или HFD хранене. От друга страна, нивата на серумна глюкоза и инсулин не са били засегнати при мишки LMP7 -/- при нормално хранене. Непоносимостта към глюкоза и чувствителността към инсулин бяха подобрени при LMP7 -/- мишки. Следователно, LMP7 влияе върху вътрешната и външната секреторна функция на панкреаса и участва в храносмилателната и хормоналната хомеостаза, което би било важно за метаболитното състояние на мишките.

В заключение ясно показваме, че дефицитът на LMP7 инхибира макрофагите, задвижвани от възпаление в мастната тъкан и засилва развитието на затлъстяване и метаболитни нарушения при мишки, хранени с HFD. Въз основа на нашите открития, ние приемаме, че дефицитът на LMP7 инхибира възпалението на мастната тъкан, като инхибира индукцията на провъзпалителни цитокини в макрофагите и адипонекцията, произведена от адипоцитите. Освен това LMP7 влияе върху външната и вътрешната секреторна функция на панкреаса. Настоящото проучване не само показва, че LMP7 може да бъде потенциална терапевтична цел за профилактика и лечение на затлъстяване и метаболитни нарушения, но също така дава нови прозрения в механизма, лежащ в основата на патофизиологията на тези нарушения.

Методи

Животни

Всички експерименти с животни са одобрени от Експерименталния комитет за грижи и употреба на животните към Ръководството за лабораторни животни на Медицинския университет в Джичи и са проведени в съответствие с насоките на Медицинския университет в Джичи. Мишките C57BL/6J WT са закупени от Japan SLC, Inc. (Hamamatsu, Япония). LMP7 -/- мишки са описани по-рано 4. Мъжките мишки (на възраст 9-10 седмици) са хранени с 60 kcal% HFD (изследователски диети: D12492, Япония LSG, Токио) или стандартна храна (CE-2; CLEA Japan Inc., Осака). Всяка мишка се претегля на всеки 2 седмици. В крайните точки мишките се гладуват в продължение на 6 часа, претеглят се отново и се събира кръв, за да се получи серум. След перфузия тъканите бяха внимателно изрязани и претеглени.

Микро-КТ анализ

Микро-КТ анализът беше извършен с LaTheta LCT-200 (Hitachi Aloka Medical, Токио, Япония). Мускулната, висцералната и подкожната мастна маса бяха анализирани с помощта на софтуера LaTheta (Hitachi Aloka Medical).

Биохимичен тест

Кръв се събира от опашната вена на 6 гладни мишки. Нивата на кръвната захар бяха измерени с помощта на измервател на кръвната захар Terumo MEDISAFE ™ (Terumo Co., Токио, Япония). Серумните или плазмените нива на TCHO и TG бяха измерени с помощта на система FUJI DRI-CHEM (Fujifilm, Токио, Япония). Серумните нива на инсулин, адипонектин и лептин са измерени с помощта на комплекти ELISA (Sibayagi, Gunma, Япония; R&D Systems Inc., Минеаполис, MN; и BioVendor R&D, Бърно, Чехия).

GTT и ITT

GTT се извършва при мишки на стандартно или HFD хранене в продължение на 8 седмици. Мишките бяха гладувани предварително 6 часа със свободен достъп до вода. След това кръвната глюкоза се измерва непосредствено преди интраперитонеална инжекция с глюкоза (1 g/kg телесно тегло във физиологичен разтвор) и впоследствие на 15, 30, 60, 90 и 120 минути след приложението. ITT се извършва по подобен начин чрез инжектиране на инсулин (0,75 U/kg телесно тегло) вместо глюкоза.

Хистология и имунохистохимия.

HE оцветяването и имунохистохимията за F4/80 и LMP7 бяха извършени, както е описано по-рано 4, 23 .

RT-PCR анализ в реално време

Общата РНК се приготвя от бъбреците с помощта на ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Toyama, Япония), съгласно инструкциите на производителя. RT-PCR анализът в реално време беше извършен с помощта на системата за откриване на зарове за термичен цикъл Takara TP960 PCR (Takara Bio Inc, Shiga, Япония) за откриване на експресия на иРНК, както е описано по-рано 23. Експресията на гени се нормализира, използвайки експресия на Actb (β-актин), използвайки софтуера, предоставен със системата. Праймерите, използвани за RT-PCR анализ, са изброени в допълнителна таблица S1.

BMT експерименти

BMT мишки се генерират, както е описано по-рано 24. За да проверим възстановяването на костния мозък след трансплантация, използвайки този протокол, използвахме мишки със зелен флуоресцентен протеин (GFP) като донори. Проточен цитометричен анализ показа, че 8 седмици след BMT, периферните кръвни клетки се състоят от повече от 90% GFP 24 положителни клетки. Използвайки този протокол, генерирахме 3 вида BMT мишки: WT → WT, LMP7 -/- → WT, WT → LMP7 -/- мишки).

Дихателни газове и двигателен анализ

Мишките бяха настанени индивидуално в метаболитна камера за 48 h, за да им позволят да се адаптират към околната среда и да постигнат постоянно съотношение на дихателен обмен (RER). Анализът на дихателните газове (O 2 и CO 2) се извършва с помощта на система за анализ на метаболитни газове с отворен кръг, свързана директно към масспектрометър (Arco2000; ArcoSystem, Chiba, Япония). Консумацията на кислород (VO 2) и производството на въглероден диоксид (VCO 2) се измерват на всеки 5 минути за всяка клетка (една мишка). RER се изчислява като съотношение VCO 2/VO 2. Общият прием на въглехидрати (CH) и прием на мазнини (FAT) бяха изчислени, използвайки стехиометричните уравнения на Frayn, както следва: CH = 4,51 × VCO 2 - 3,18 × VO 2 [mg/min] и FAT = 1,67 × (VO 2 - VCO 2) [mg/min]. Локомоторната активност се определя на всеки 5 минути за всяка камера (една мишка) от броя на инфрачервените лъчи, счупени както в X, така и в Y посоките, използвайки система за мониторинг на активността (ACTIMO-100; Shinfactory, Fukuoka, Япония), комбинирана с метаболитни камери.

Събиране на изпражнения и екстракция на липидни изпражнения

HFD-захранени миши изпражнения, поместени индивидуално за 24 часа, бяха събрани и изсушени чрез вакуумно центрофугиране. Изсушените изпражнения се претеглят и смилат в хаванче. Смлените изпражнения се прехвърлят в стъклена тръба и се претеглят отново. Липидите се екстрахират с помощта на хлороформ: метанол (2: 1) два пъти по метода на Folch и се претеглят. Съдържанието на липиди се изчислява като% от теглото на смлените изпражнения.

Анализ на поточната цитометрия

Инфилтриращите левкоцити в епидидималната WAT се анализират чрез поточна цитометрия, както е описано по-горе 11. Данните за поточната цитометрия бяха получени с помощта на FACSVerse (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния) и анализирани с помощта на софтуера FlowJo (Treestar, Inc., San Carlos, CA). Реагентите, използвани за анализ на поточна цитометрия, са изброени в допълнителна таблица S2.

Експерименти ин витро

Миши перитонеални макрофаги се култивират в RPMI1640 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), допълнени с 10% фетален говежди серум (FBS) и 1% антибиотик - антимикотик (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), като се използват плочи с 24 ямки. След 48 часа клетките се стимулират с 400 μM палмитат (10% BSA) 26 за 24 часа. Нивата на IL-1β, IL-6 и TNF-α в супернатантите бяха определени с помощта на ELISA комплекти (R&D Systems Inc.).

статистически анализ

Резултатите с нормално разпределение бяха анализирани чрез параметричен несдвоен t-тест. Резултатите без нормално разпределение бяха анализирани чрез теста на Ман - Уитни, теста на Крускал - Уолис или надлъжния анализ. Всички анализи бяха извършени с помощта на софтуер Stata, издание 13 (Stata Corp., College Station, TX). P -значение на