МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

дроб

А. БИОЛОГИЧЕН МАТЕРИАЛ
Използвани са мъжки плъхове Sprague Dowley, разделени на 2 групи и по 4 подгрупи, със средно тегло на група от 194 до 202 g в началото на експеримента.

Б. ДИЕТИ
Подготвените диети бяха четири за всяка група (общо 8) и бяха наречени:

Група I: група, която е погълнала колбаса и е разделена на:
IDC: Контролна диета (10 mg Vit. E/K диета)
IDCE: Контролна диета с вит. E (257 mg вит. E/K диета)
ИД: Проблем с диетата (20% от хот-дога в диетата)
IDPE: Диетичен проблем с вит. E (257 mg вит. E/K диета)

Група II: групата, на която е прилаган нитрит (5 mg/d под формата на натриев нитрит), е разделена на:
IIDC: Контролна диета (10 mg Vit. E/K диета)
IIDCE: Контролна диета с вит. E (257 mg вит. E/K диета)
IIDP: Контролна диета с нитрит (5 mg нитрит/ден)
IIDPE: Контролна диета с vit.E и нитрит (5 mg нитрит/ден)

Те получавали храна и вода ad libitum. Конституцията на всяка от диетите е показана в таблицата за състава на диетите.

СЪСТАВ НА ДИЕТА***


*Обезмасленото мляко се използва вместо казеин.
**С изключение на витамин Е
***Диетите IDCE и IDPE също съдържат 257 mg витамин Е/К диета,
****Подгрупата IIDP консумира IDC диета плюс 5 mg натриев нитрит/ден (приблизително 11 mg/K/d)
Подгрупата IIPE консумира диетата IDCE плюс 5 mg натриев нитрит/ден (приблизително 11 mg/K/d)
Подгрупата IIDC консумира диетата IDC
Подгрупата IIDCE консумира диетата IDCE

В. РЕАКТИВИ:
Всички реактиви са с аналитично качество. Натриев карбонат, натриев бикарбонат, солна киселина, мононатриев фосфат, динатриев фосфат и водороден пероксид са закупени от E. Merck. Епинефрин, EDTA, BSA, bc. тиобарбитурат, CDBN и GSH са получени от Sigma Chemical Co. Витамин Е е дарен от Swiss Chemistry.

Плъховете бяха поставени индивидуално в метални клетки в лека и проветрива среда. Те получиха дванадесет часа светлина и дванадесет часа тъмнина и стайна температура 26 ± 1 градус С. Лечението беше 12 седмици (краткосрочно) [15].

След 12 седмици животните бяха умъртвени чрез обезглавяване и черният дроб незабавно беше отстранен, поставен в ледена баня и след това част от черния дроб беше почистена, претеглена и отделена (1,5 g) от по-големия лоб. Който беше измит с среда за хомогенизиране за отстраняване на кръвта (три пъти). 10% w/v хомогенат се приготвя в стъклен хомогенизатор от тип Potter-Elvehjem с тефлоново бутало. Средата за хомогенизиране съдържа 50 mmol/L натриев фосфатен буфер, рН 7,0.

Хомогенатът се центрофугира при 750 g X 10 минути за отстраняване на непокътнати клетки, ядра и остатъци от клетъчна мембрана. Второ центрофугиране на супернатанта при 9 800 g X 15 минути за елиминиране на митохондриите и трето центрофугиране за получаване на "цитозол", супернатантът от второто центрофугиране се извършва при 22 000 g X 100 минути. Всички центрофугирания бяха проведени в центрофуга тип RC2-B на Sorvall, ротор SS34 при температура между 0 и 5 градуса по Целзий.

1. Измерване на липопероксидацията:
Извършва се съгласно техниката на Buege and Aust [5] с някои модификации, измервайки производството на малондиалдехид, който при взаимодействие с TBA образува оцветен комплекс, който се отчита при 535 nm.
Процедурата беше: 0,5 мл хомогенат плюс 1,0 мл 20% ТСА, поставете във вряща водна баня за 10 минути, охладете и добавете 1,5 мл 0,67% ТБА 0,25 НС1 N, врящата вода се отвежда отново във ваната за 30 мин. Охлажда се в ледена вода и се центрофугира при 4000 об/мин за 10 минути, отстранява се супернатантата и се отчита.
За изчисленията беше използван моларен коефициент на екстинкция 1,56 X 10 5 mmol -1 cm -1 от оцветения комплекс, образуван от малондиалдехид-тиобарбитурат.

2. SOD дейност:
Използван е методът на Мисра и Фридович [37], модифициран от Сън и Зигман [47], който се основава на способността на SOD да инхибира автоксидацията на епинефрин до адренохром.
Реакционната кювета съдържа 2,94 ml 0,05 mol/L карбонатен буфер, рН 10,2, 1 X 10 -4 mol/L EDTA и 10 uL цитозол. Реакцията започва чрез добавяне на 50 uL епинефрин 5,5 mg/ml. Прочетете при 320 nm.
Изчисленията са направени от данните, получени от линейната част на реакционната кинетика.
Единицата SOD се определя като количеството ензим, което инхибира автоксидацията на 50% от общия епинефрин, присъстващ в реакцията.

3. Глутатион трансферазна активност:
Извършва се по техниката на Habig et al. [28].
Основата на реакцията е способността на GSH да конюгира с CDNB. Увеличението на абсорбцията при 340 nm за 1 min е пряко пропорционално на активността на присъстващия ензим.
В тестовата клетка от 1 ml поставете 940 uL буфер, съдържащ 0,1 mol/L фосфатен буфер, рН 6,5 и 3,3 mg GSH, добавете 40 uL етанолов разтвор на CDNB при 0, 5065 g%, инкубирайте при 25 градуса по Целзий за 5 минути и реакцията започва чрез добавяне на 20 uL цитозол.
За изчисленията се използва моларен коефициент на коефициент на CDNB 9,6 mM -1 m -1 .

4. Определяне на протеини:
Протеините на хомогената и на цитозола са получени съгласно техниката на Лоури [34].
Спектрофотометричните измервания бяха извършени на Gilford модел 240, рекордерът също Gilford модел 6051 и на LKB модел Ultrospec II спектър, свързан към компютър на Apple.