Обобщение

Включването на антитяло, получен от лизин циклопропен, позволява специфично, бързо и ефективно свързване на молекули, носещи тетразин, за генериране на конюгирани лекарства за антитела.

Резюме

Въведение

Конюгатите антитяло-лекарство (ADC) съчетават селективността на биотерапевтиците и силата на малките цитотоксични молекули. Повечето ADC твърдят, че намаляват страничните ефекти на традиционната химиотерапия чрез насочване към лекарства, които влияят на полимеризацията на ДНК или микротубулите на раковите клетки 1. ADC от първо поколение, одобрени от Администрацията по храните и лекарствата (FDA), се основават на модификацията на лизини и цистеини, която генерира смеси от модифицирани молекули в различни позиции с намалени фармакокинетични свойства 2. Напротив, специфичното конюгиране на лекарства за антитела може да генерира съединения с по-добри терапевтични показатели 3, 4. Опитвайки се да се справи с предизвикателството да произвежда хомогенни ADC, са докладвани няколко селективни химически и ензимни модификации 1, 5. Съвременните методи обаче могат да насочват само към определена позиция върху антитялото, да страдат от ниска експресия на протеин, да осигуряват линкери с ниска стабилност или да разчитат на бавни реакции и нисък добив.

Включването на неканонични аминокиселини (ncAA) чрез разширяване на генетичния код позволява специфичното за мястото инсталиране на множество реактивни биоортогонални групи в протеини, потенциално преодоляване на ограниченията на други методи, използвани за генериране на ADC. Кодирането на ncAA в отговор на прицелен (стоп) кодон се основава на двойки аминоацил-тРНК синтетаза/тРНК, които са ортогонални на ендогенни двойки, които включват 6 канонични аминокиселини. Няколко NcAA са включени в антитела за генериране на ADC. Въпреки това, различни задължения страдат повече за приложения в конюгирането на терапевтични лекарства. p-ацетилфенилаланин (pAcF) 7, 8 не е напълно биоортогонален, изисква ниско рН (4,5) и дълги времена на реакция (> 60 часа), докато азиди като p-азидофенилаланин (pAzF) 7, 9, 10, p- азидометилфенилаланин (обръщане) 11 и производно на лизин азид (AzK) 12, 13 могат да бъдат редуцирани в клетка 14, а медта, използвана за катализиране на активността на Huisgen, може да предизвика окислително увреждане 15 .

Въпреки че алтернативните ncAAs-циклооктен (TCO), циклооктин (SCO) и бицикло [6.1.0] нонен (BCN), базирани на транспорт, са наскоро кодирани в антитяло за целите на биоизобразяването, експресионната система страда от много ниски добиви (0,5 mg/L) 16. От друга страна, циклооктените и циклооктините са големи и хидрофобни дръжки, които могат да увеличат податливостта на ADC към полезни натоварвания - ADC за агрегиране традиционно са хидрофобни и физикохимичните свойства на машината за колбаси показват висок индекс на фармакокинетично и терапевтично въздействие 17. За разлика от тях, 1,3-заместените циклопропени са малки реактивни групи, които трябва да причинят минимални промени в структурата на протеините и физикохимичните свойства 18. Циклопропените селективно и бързо реагират с тетразини чрез циклопридаване на Дилс-Алдер на обратното електронно търсене 19. В този протокол използваме производно на лизин (CypK, Фигура 1b) метил циклопропен, който е по-малко засегнат от стерично препятствие от по-големите филтрирани ненаситени пръстени и има константа на скоростта на реакция от порядъка на 1-30 M -1 s -1 във водна среда 18, 20 .

Наскоро той ни информира как да включим CypK в антитела, за да генерираме ADC, като реагираме на този биоортогонален минимален вал с молекули, носещи тетразин 21. Тук описваме по-подробно процедурата за подготовка на ADC с акцент върху по-трудните стъпки. Включването на CypK е насочено с двойка пиролизил-тРНК синтетаза (PylRS)/tRNACUA (PylT) в отговор на кехлибарен кодон, въведен в тежката верига на антитялото (HC) 22. Тук използваме два плазмида за преходна трансфекция (Фигура 1а), кодираща тежката верига на антитялото и другата, кодираща леката верига (LC), и двете съдържащи касетата PylRS/PylT. Алтернативно, стабилна клетъчна линия, която позволява по-високи добиви на антитялото, може да бъде генерирана чрез по-трудоемка процедура. .

Горните експресионни системи могат да произвеждат терапевтичен анти-HER2 имуноглобулин 1 (IgG1) трастузумаб с CypK на нива, подобни на антитела от див тип. Избрахме първата позиция CH1 домейна на тежката верига за кодиране на ncAA (HC-118TAG). Това е най-често модифицираният сайт в ADC 23 и е известен като HC-118 (изброяване на ЕС), но също така е известен като HC-121 (позиция на последователността) и HC-114 (изброяване на Кабат) 24. Тъй като тази позиция се запазва по време на IgG1, тези експресионни системи трябва да бъдат податливи на най-много терапевтични антитела.

Ние показваме, че трастузумаб (CypK) 2 може лесно да бъде пречистен от протеин А, последван от бърза протеинова течна хроматография с колона за хидрофобно взаимодействие (HIC-FPLC). Впоследствие антитялото е ковалентно в рамките на 3 часа към инхибитора на полимеризацията на микротубулите монометил ауристатин Е (MMAE), който се използва в одобрения от FDA Adcetris ADC. Тук използваме бензилово производно тетразин ММАЕ (тетразин-vcMMAE) с линкер, съдържащ глутарен дистанционер и лабилен компонент на валин-цитрулин протеаза, последван от самоизолираща p-аминобензилалкохолна единица; Този линкер се разцепва от катепсин В в лизозомата при интернализация на ADC, което води до освобождаване на токсин 25, без да оставя следи. За да се демонстрира амплитудата на реакцията, че антитялото е свързано и с флуорофорния тетраметилродамин (TAMRA). Обясняваме как да проверим идентичността на конюгата чрез течна хроматография, свързана с масспектрометрия (LC-MS) и да изчислим съотношението лекарство-антитяло (DAR) чрез високоефективна течна хроматография с колона за хидрофобно взаимодействие (HIC-HPLC) .

Като част от характеризирането на ефективността на антителата, ние описваме как да проверим стабилността на дихидропиридазиновата става в човешки серум. Този параметър се оценява по-лесно в трастузумаб-ТАМРА, тъй като може да се изчисли количествено чрез проста ELISA и интерпретацията на резултатите не се усложнява от лабилния компонент на трастузумаб протеазата (ММАЕ) 2. И накрая, селективността и ефективността на трастузумаб (MMAE) 2 се оценява чрез сравняване на цитоксичността на ADC в клетъчните линии, изразяващи различни нива на HER2. Този анализ също така осигурява функционален тест за стабилност на ADC, когато имуноконюгатът се извършва след инкубация в човешки серум.

Протокол

1. произвеждат и характеризират антителата

4. оценка на цитотоксичността на ADC

Забележка: Този протокол се основава на съобщени по-рано опити 23, 26 с някои модификации.

Представителни резултати

Разкритата преходна система за изразяване (Фигура 1а) произвежда 22 ± 2 mg трастузумаб (CypK) 2 на литър хранителна среда, което представлява 2/3 от антитялото от див тип, получено при същите условия (Фигура 1С). Стабилната клетъчна линия може да увеличи този добив до 2 mg/L ± 31 21 .

Трастузумаб (CypK) 2 може да бъде конюгиран с тетразин-vcMMAE, който дава почти хомогенен трастузумаб (MMAE) 2 до 3 часа при 25 ° C (Фигура 2). Високата хидрофобност на този цитотоксин изисква добавяне на 10% ацетонитрил, когато се използват 5 или повече моларни еквивалента на токсина за CypK. От друга страна, циклоприбавянето също завършва в рамките на 20 часа с 2 еквивалента тетразин-vcMMAE без ацетонитрил (Фигура 2С). Трастузумаб (CypK) 2 реагира с тетразин-TAMRA в рамките на 2 часа при 25 ° C и се изисква 3-6 часа, когато температурата се понижи до 4 ° C (Фигура 3C).

Прогнозираният DAR за трастузумаб (MMAE) 2, измерен чрез HPLC-HIC, е 1,9 (Фигура 2b). Първоначално пикът, наблюдаван в хроматограмата на 8.0 минути, представлява неконюгираното антитяло (DAR 0) и е трябвало да изчезне напълно, когато реакцията завърши. Видовете с DAR 1 елуират 9,1 9,6 минути и трябва да имат 90% площ. Завоят на мобилността и флуоресценцията в SDS-PAGE гелове потвърждава включването на TAMRA (фигура 3b) и идентичността на имуноконюгатите се проверява чрез LC-MS (Фигура 2г-и y Фигура 3d).

Инкубация на трастузумаб (TAMRA) 2 в продължение на 5 дни в човешки серум и последващ анализ чрез ELISA потвърждава, че натоварването остава свързано с антитялото (Фигура 4b). При анализа на цитотоксичността трастузумаб (MMAE) 2 показва висока активност в SK-BR-3 ракови клетки на гърдата (висока HER2), със средна максимална ефективна концентрация (EC50) от 55 ± 22:00 (Фигура 4 d). Трастузумаб (MMAE) 2 поддържа цитотоксичност след 5 дни инкубация в човешки серум (Фигура 4 c). За разлика от това, когато ADC се анализира в MCF-7 (нисък HER2), EC50 е 200 пъти по-нисък (Фигура 4 d). Антителата от див тип, трастузумаб (CypK) 2 и тетразин-vcMMAE показват изключително ниска токсичност (4е и 4 фигури d), докато MMAE показва висока неселективна цитотоксичност и в двете клетъчни линии (Фигура 4д).

неканонична

Фигура 1: преходна система за изразяване. ДА СЕ. регионите на плазмидите, използвани за преходна трансфекция в клетки HEK293. CMV: промотор на цитомегаловирус, WPRE: посттранскрипционен регулаторен елемент на вируса на хепатит от мармот, PylT: пиролизил тРНК, U6: специфичен промотор, PylRS: пиролизил тРНК синтетаза,> и ε - [((2-метилциклопроп-2-ен- 1- ил) метокси) карбонил] -L-лизин (CypK). ° С. Експресионните добиви от див тип трастузумаб (WT) и трастузумаб (CypK) 2, измерени в Western blot след пречистване на протеини. Лентите за грешки представляват стандартното отклонение на биологичните три повторения. Тази цифра е променена с разрешение от Oller-Salvia et al. 2018 21. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


Фигура 2: Конюгиране на трастузумаб (CypK) 2 с тетразин-vcMMAE. ДА СЕ. Електронното реверсиране изисква циклодидиция на Diels-Alder между остатъка CypK в антитялото и тетразиновото производно на MMAE. Реакционните групи са маркирани в червено, p-аминобензилалкохолът е представен в зелено, а валин-цитрулин дипептидът в синьо. Б. HPLC-HIC хроматограми, показващи напредъка на конюгацията на антитела. ° С. степен на конверсия по отношение на максимален DAR от 1,9 с различни концентрации на реагенти. НА. Деконволютирани мас спектри на антителата с пълна дължина преди и след конюгация. Трастузумаб (CypK) 2 е получен с помощта на стабилната клетъчна линия. Тази цифра е променена с разрешение от Oller-Salvia et al. 2018 21. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


Фигура 3: Конюгиране на трастузумаб (CypK) 2 с тетразин-TAMRA. ДА СЕ. Електронни реверсивни изисквания на циклодидиция на Дилс-Алд между остатъка CypK в антитялото и тетразиновото производно на TAMRA. Б. SDS-PAGE гелове, показващи промяна в подвижността и флуоресценция на гела, произхождащи от конюгация TAMRA. ° С. словесна кинетика при две различни температури. д. Деконволютиран мас спектър на трастузумаб (TAMRA) 2. Трастузумаб (CypK) 2 е получен с помощта на стабилната клетъчна линия. Тази цифра е променена с разрешение от Oller-Salvia et al. 2018 21. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


Фигура 4: Серумна стабилност и цитотоксичност на конюгатите на трастузумаб. ДА СЕ. чертежи, подчертаващи желаните характеристики във вътрешен ADC. Б. стабилност на трастузумаб (TAMRA) 2 в човешки серум, измерена чрез ELISA. ° С. анализ на жизнеспособността на клетките с трастузумаб (MMAE) 2 след 5 дни в човешки серум (+ серум, черен). Контролна проба беше инкубирана в PBS, вместо серум (-серум, червен) беше включен в нейния анализ. д. анализ на жизнеспособността на клетките с прясно разредени проби от антитела. И. анализ на жизнеспособността на клетките с прясно разредени MMAE производни. Лентите за грешки представляват стандартната грешка на средната стойност на 3 независими експеримента. Тази цифра е променена с разрешение от Oller-Salvia et al. 2018 21. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Дискусия

Процедурата за преходна експресия за получаване на трастузумаб (CypK) 2, описана в този протокол, е проста и позволява висока модулност. Получените добиви са в рамките на очакваните в академична среда 27 и могат да се генерират стабилни клетъчни линии за по-нататъшно подобряване на производителността 21. По време на експресията, концентрациите на CypK под 5 mM могат да доведат до по-малко включване на ncAA, а по-високите количества могат да повлияят на клетъчния растеж и да намалят производството на антитела. CypK като свободна аминокиселина има ниска разтворимост във вода, поради което първо трябва да се разтвори в 100 mM 0,1 М NaOH и след това да се добави към хранителната среда. След разреждане на CypK в средата и преди добавяне към клетките е от съществено значение средата да се неутрализира със солна киселина и филтърът да се стерилизира. Впоследствие използването на трансфекционните реагенти, посочени в този протокол, и спазването на препоръчаните от производителя времена на инкубация е важно за високопроизводителната експресия. За да се получи повече информация за преходната експресия на човешки антитела, читателят е насочен към други публикувани протоколи 31, 32 .

Описаната ADC технология позволява ефективно и специфично включване на циклопропеново производно на лизин в IgG1s. След лесно пречистване, антителата могат бързо да се конюгират със съдържащи тетразин молекули, като се получават хомогенни продукти. Поради малкия размер и високата реактивност на минималната дръжка циклопропен, този метод трябва да позволява конюгиране на стерично затруднени заряди. Получените имуноконюгати са стабилни в серума и са много мощни и селективни. Най-общо, CypK позволява бързо, специфично и стабилно биоортогонално свързване на антитела и други конюгирани протеини за използване в терапията или в диагностиката.