хематопоетичните

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Гладуването предизвиква миграция на хемопоетични клетки към PVN
  • Характеристики на хематопоетичните клетки в PVN
  • BDNF-експресиращите микроглии са в контакт с PVN неврони
  • Мишките с BM-специфична BDNF делеция са хиперфагични и затлъстели
  • BMT спасява метаболитните аномалии от дефицит на BDNF
  • Дискусия
  • Методи
  • Животни и изследвания in vivo.
  • Имунохистохимия и имуноелектронна микроскопия
  • Микродисекция с лазерно улавяне и изолиране на РНК
  • Количествена RT-PCR
  • ДНК микрочипове
  • Хидролизни сонди в RT - PCR за BDNF варианти
  • Интрацеребровентрикуларно инжектиране на мононуклеарни клетки
  • статистически анализ
  • Допълнителна информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

Субекти

  • Хематопоетични стволови клетки
  • Хипоталамус
  • Невротрофни фактори
  • Затлъстяване

Обобщение

Извлеченият от мозъка невротрофичен фактор (BDNF) потиска приема на храна, като действа върху невроните в хипоталамуса. Тук показваме, че BDNF-продуциращите хематопоетични клетки контролират апетита и енергийния баланс чрез мигриране към паравентрикуларното ядро ​​на хипоталамуса. Тези получени от хемопоетични паравентрикуларни ядрени клетки произвеждат микроглиални маркери и осъществяват директен контакт с неврони в отговор на състоянието на хранене. Мишките с вроден дефицит на BDNF, по-специално на хемопоетични клетки, развиват хиперфагия, затлъстяване и инсулинова резистентност. Тези аномалии се подобряват чрез трансплантация на костен мозък с клетки от костен мозък от див тип. Освен това, когато се инжектират в третата камера, мононуклеарните клетки от костен мозък от див тип приютяват паравентрикуларното ядро ​​и обратната хиперфагия при мишки с дефицит на BDNF. Нашите резултати предполагат нов механизъм за контрол на храненето, основан на производството на BDNF от хематопоетични клетки и подчертават възможен нов терапевтичен път за лечение на затлъстяването.

Въведение

Извлеченият от мозъка невротрофичен фактор (BDNF), член на семейството на невротрофините, се изразява широко в мозъка, включително в ключови хипоталамусни ядра, за които е известно, че са важни за регулирането на енергийния баланс 1, и в периферните тъкани, като мускули, черен дроб, мазнини и хемопоетични клетки. 2. 3. 4. В допълнение към ролята си в невротрофното действие, BDNF е централен регулатор на енергийната хомеостаза. Интрацеребровентрикуларната инфузия на BDNF при гризачи намалява диетата и телесното тегло 5, 6. За разлика от това, мишките, които губят едно копие на гена Bdnf, развиват хиперфагия и затлъстяване 7, 8. При хората генетичната хаплоинсуфициентност на BDNF 9, мутациите в гена, кодиращ неговия TrkB рецептор (NTRK2) 10, и проучванията за асоцииране в целия геном 11, 12 колективно включват BDNF в регулирането на приема на храна и развитието на затлъстяване.

За да идентифицират произхода на производството на BDNF за регулиране на енергийния баланс, предишни изследвания се фокусираха върху цели мозъчни неврони или специфични ядра в хипоталамуса 13. Като се имат предвид неотдавнашните открития, че хематопоетичните клетки съдържат мозъчни тъкани и че хематопоетичните клетки изобилно експресират BDNF 2, 3, 4, ние изследвахме дали BDNF, произведен от хематопоетични клетки, които приютяват мозъчни тъкани, участва в енергийния баланс и регулирането на апетита.

Резултати

Гладуването предизвиква миграция на хемопоетични клетки към PVN

Осем седмични мишки C57BL/6 получиха облъчване на цялото тяло (9 Gy) и трансплантация на костен мозък (BM) (BMT) от зелен флуоресцентен протеин (GFP) 14 трансгенни мишки C57BL/6. Осем седмици по-късно преброихме броя на получени от BM клетки, експресиращи GFP в различни хипоталамусни ядра при различни условия на хранене (Фиг. 1а-в). Открихме, че получените от BM хематопоетични клетки са насочени към хипоталамуса, по-специално към паравентрикуларното ядро ​​(PVN), център за ситост за ядене и пиене. Интересното е, че гладуването (16 или 24 часа) доведе до значително по-голям брой GFP + клетки в PVN (фиг. 1б); броят се връща към изходното ниво в рамките на 4 часа след повторното подаване след 16 часа бързо (фиг. 1в). GFP + клетъчната плътност не се е променила значително в други изследвани ядра на хипоталамуса (Фиг. 1г).

40% от GFP + клетки произвеждат трансформиращ растежен фактор β (допълнителна фигура S1b), фактор, получен от микроглия, който поддържа оцеляването на невроните 17 .

Характеристики на хематопоетичните клетки в PVN

Мишките с BM-специфична BDNF делеция са хиперфагични и затлъстели

Изображение в пълен размер

( да се - ° С ) Сравнение на телесното тегло ( да се ), прием на храна ( б ) и прием на вода ( ° С ) в мишки BM-BDNF -/- и Cre (BM-BDNF +/+) (n = 10). Горна: мъжка, долна: женска. ( д ) Сравнение на нивата на глюкоза и инсулин и съответната AUC при интраперитонеална GTT при BM-BDNF -/- мишки и Cre контрол (n = 8-11). GTT, тест за глюкозен толеранс; AUC, площ под кривата. ( и ) Консумация на O 2 на BM-BDNF -/- в сравнение с контролните мишки Cre в светъл и тъмен период (n = 12). Всички данни представляват средни стойности ± sd * P

( а - в ) Телесно тегло ( да се ), ядене на храна ( б ) и прием на вода ( ° С ) при BM-BDNF -/- мишки, получаващи BMT от BM-BDNF +/+ или BM-BDNF -/- мишки (n = 10) Графики горни: мъжки, долни: женски. ( д ) Нива на глюкоза и инсулин и съответната площ под кривата (AUC) 5 месеца след BMT в същите групи като в да се (n = 5–6) в GTT. ( и ) Консумация на O 2 6 месеца след BMT в същите експериментални групи като в да се (п = 9). Промени в приема на храна ( F ) и вода ( ж ) след интрацеребровентрикуларна инжекция на мононуклеарни клетки (n = 4–6). Данни: средно 7 дни след инжектиране на клетки. ( з ) Микроскопски анализ на GFP-положителни клетки, инжектирани в PVN. Ляв панел: BM-MNC, изолирани от GFP-Tg/BDNF +/+ мишки, се инжектират в третата камера (3V) на BM-BDNF -/- мишки. Десен панел: Инжектирани са BM-MNC, изолирани от GFP-Tg/BDNF -/- мишки. Стрелка: GFP-положителни клетки. Скала, 50 μm. Всички данни представляват средни стойности ± sd * P + P = 0,06, + P = 0,08.

Изображение в пълен размер

Тъй като моноцитите и макрофагите присъстват в множество органи 27, делецията на гена BDNF в отговор на активността на Cre, задвижвана от промотора на LysM, може да не бъде ограничена до мозъчни микроглиални клетки. Следователно сравнихме ефектите от инжектиране на физиологичен разтвор или BM-MNC, изолирани от GFP-TG/BDNF +/+ или GFP-TG/BM-BDNF -/- мишки в третата камера на BM-BDNF -/мишки. В рамките на сравнително кратък 8-дневен период на интрацереброваскуларно инжектиране, по време на който имаше значително намаляване на приема на храна (фиг. 5е) и вода (фиг. 5ж) при GFP-TG/BDNF + BMT рецептори на хематопоетични клетки +, донор GFP + Клетки, получени от BM, се откриват в рамките на PVN на реципиентни мишки (Фиг. 5h).

Дискусия

Многобройни доказателства, представени в това проучване, показват, че BDNF, получен от хематопоетични клетки, изглежда е толкова важен, колкото BDNF, получен от неврони, за контролиране на апетита и затлъстяването при възрастни животни. В отговор на 16-часово гладуване, хемопоетичните клетки приютяват PVN, където придобиват много от характеристиките на микроглията и влизат в контакт с местните неврони. Чрез производството на специфичен хемопоетичен вариант BDNF, тези получени от BM клетки регулират приема на храна чрез PVN.

Важно е да се отбележи, че предизвиканото от гладуване насочване на получени от BM клетки до PVN се случва както при облъчени от цялото тяло мишки в отсъствие, така и в присъствието на защитни шапки. Облъчването на ЦНС само по себе си може да причини увреждане на васкулатурата в мозъка и да позволи необичайно навлизане на микроглиални предшественици от циркулацията в ЦНС. Ние обаче показахме, че в нашите експериментални условия се наблюдава само незначително и незначително увеличение (

17%) в броя на клетките, получени от BM, които мигрират към PVN при мишки без шапки в сравнение с тези с шапки. Освен това, 16-часовото бързо предизвикване на сравнително увеличаване на броя на хематопоетичните клетки, насочени към PVN при мишки, защитени от главата, в сравнение с облъчени незащитени мишки.

Естеството на сигнала, който стимулира миграцията на хематопоетичните клетки към PVN, изисква допълнителни изследвания. Интригуващо е обаче, че анализът на микрочипове разкрива, че иРНК за Cxcl2, хемокин, произведен от ендотелни и невронални клетки, е> 30 пъти по-висок в PVN на гладни мишки в сравнение с хранени мишки (допълнителна таблица S2). Хемокините и цитокините са замесени в търсенето на микроглии или клетки, получени от BM в нервната система, особено в отговор на нараняване или исхемия в мозъка 17 или нараняване на гръбначния мозък 29. Cxcl2 показва мощна хемотаксична активност спрямо трафика на BM/хематопоетични клетки. Неговата възходяща експресия в PVN при тези животни може да бъде спусък за миграцията на клетки, получени от BM, към PVN по време на 16-часовия пост.

Това е първоначалният доклад за предизвиканото от гладуване насочване на хематопоетични клетки към PVN, хипоталамусно ядро, където BDNF, произведен от тези клетки, може да регулира отрицателно апетита. Ефективността на BDNF, получен от BM, върху апетита in vivo е очевидна при BM-BDNF -/- мишки, чиято неспособност да реагират на гладно чрез прекомерно производство на BDNF в техните PVN се проявява като полидипсия, хиперфагия и затлъстяване. Други лаборатории съобщават, че гладуването предизвиква намаляване на

Методи

Проучвания върху животни и in vivo.

Имунохистохимия и имуноелектронна микроскопия

Микродисекция с лазерно улавяне и изолиране на РНК

Проби от тъкани от замразени участъци с дебелина 12 μm за анализ на РНК са получени от всяко хипоталамусно ядро ​​или 50 уловени GFP-положителни или отрицателни клетки върху единична капачка CapSure HS LCM (Arcturus Engineering, Mountain View, CA), като се използват следните параметри: размер на петно ​​= 7,5 µm; мощност = 50–80 mW; и продължителност на импулса = 50–1000 μs. Общите РНК бяха изолирани с PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturs) и третирани с DNase I (Invitrogen).

Количествена RT-PCR

Извършихме количествена RT - PCR с LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit и LightCycler 480 Probe Master (Roche Diagnostics). Излъчената флуоресценция за всяка реакция беше измерена три пъти по време на фазата на отгряване/удължаване и амплификационните диаграми бяха анализирани с помощта на LIGHT CYCLER 480 System II (Roche Diagnostics). Потенциалното замърсяване на геномната ДНК се контролира чрез използването на някои обхващащи интрон праймери и разлагане на DNase. Относителната стойност във всяка проба се изчислява по стандартната крива, получена от контролни проби и се стандартизира като коефициент, разделен на стойността, получена едновременно за глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) в същия експеримент. CDNA с първа верига се използва при последващи PCR анализи. Използвани са следните праймери: BDNF; 5 ′ праймер нагоре по течението, 5′-TTGTTTTGTGCCGTTTACCA-3 ′ и 3 ′ грунд надолу по веригата, 5′-GGTAAGAGAGCCAGCCACTG-3 ′, GAPDH; 5 ′ праймер нагоре по веригата, 5′-AACGACCCCTTCATTGAC-3 ′ и 3 ′ грунд надолу по веригата, 5′-TCCACGACATACTCAGCAC-3 ′. Идентичността на PCR продуктите се потвърждава от размера след електрофореза в агарозен гел и анализ на нуклеотидна последователност. Сигналът, произтичащ от GAPDH иРНК, служи като вътрешен контрол за оценка на разликите между различни проби.

ДНК микрочипове

Уловихме GFP-положителни клетки от пет различни мишки GFP-BMT или цели PVN от пет мишки от див тип, както в хранене, така и на гладно (16 часа) от LCM. Пробите бяха изпратени до Bio Matrix Research Laboratory (Япония), където пробите от РНК бяха проверени от Agilent 2100 BioAnalyser (Agilent Technologies) и NanoDrop (NanoDrop Technologies). Пробите от РНК се амплифицират чрез двуциклено целево маркиране, превръщат се в биотинилирана кДНК и се хибридизират в масива Affymetrix Mouse Genome U34A GeneChip (Санта Клара, Калифорния). Използвахме Gene Spring Viewer (Agilent Technologies), за да анализираме данните и изчислихме съотношението на изразяване (r = на гладно/хранене). Показахме експресията на гени, свързани с микроглията (LCM на GFP-положителни клетки), и цитокини и гени, свързани с възпалението (LCM на цели PVN) с резултат r> 2 и r 21 (допълнителна таблица S4). Амплификацията се извършва с PCR тестове в реално време, като се използват 5′FAM сонди (Sigma Genosys) на LIGHT CYCLER 480 System II (Roche Diagnostics). Крайният реакционен обем от 20 μl включва 5 μl cDNA, 0,5 μM от всеки праймер (преден праймер и обратен праймер), 0,1 μM от 5′FAM сонда и 10 μl LightCycler 480 Probes Master (Roche Diagnostics).

Интрацеребровентрикуларно инжектиране на мононуклеарни клетки

Изолирахме мононуклеарната клетъчна фракция от BM на мишка, използвайки Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). След обезболяване, главата на мишките беше закрепена с помощта на стереотаксични инструменти (SR-6, Scientific Instrument Lab., Токио, Япония). Клетките се инжектират в третата камера с помощта на 30-G игла, прикрепена към спринцовка Hamilton, съгласно координатите, получени от учебника от Paxinos и Watson 34 (-0,82 mm от брегмата). Инжектираният обем на клетъчната суспензия е 5 μl и броят на клетките на мишка е 1 × 106 .

статистически анализ

Резултатите са представени като средни стойности ± sd Статистическият анализ е извършен с помощта на софтуера SPSS Statistics 19. T-тестът на Student е използван за сравняване на две независими групи, а еднопосочният дисперсионен анализ или дисперсионният анализ с повторна мярка, последван от теста за многократно сравнение, е използван за сравнение на три или повече групи. Статистически значима разлика беше определена като P-стойност