Обобщение

Бързото развитие на малки размери и прозрачност на зебрата са големи предимства за изследването на вродения имунен контрол на инфекцията 1-4. Тук са ни показани техники за заразяване на ларви на зебра с патогенната гъба Candida albicans Чрез микроинжектиране, методологията, използвана наскоро за включване на активността на фагоцитите на NADPH оксидаза в контрола на диморфизма на гъби 5 .

Резюме

Дисеминираната кандидоза, причинена от патогена Candida albicans, е клинично важен проблем при хоспитализираните лица и е свързана със смъртност от 30–40% 6. Системната кандидоза обикновено се контролира от вродения имунитет и хората с генетични дефекти на вродените имунни клетъчни компоненти като фагоцитна NADPH оксидаза са по-податливи на кандидемия 7-9. Много малко се знае за динамиката на взаимодействието на C. albicans с имунните клетки in vivo. Обширни in vitro проучвания показват, че извън гостоприемника C. albicans покълва в макрофагите и бързо се унищожава от неутрофили 10-14. Проучванията in vitro, макар и полезни, не могат да обобщят комплекса в жизнена среда, което включва зависима от времето динамика на нивата на цитокини, прикачени извънклетъчни матрици и междуклетъчни контакти 10, 15-18. За да се изследва приноса на тези фактори във взаимодействието между гостоприемника и патогена, е от решаващо значение да се намери моделен организъм, който да визуализира тези аспекти на инфекцията неинвазивно при непокътнат жив гостоприемник.

Ларвите на Zebrafish предлагат уникален и многостранен гръбначен гостоприемник за изследване на инфекцията. През първите 30 дни от развитието на ларвите на зебра имат само вродена имунна защита 2, 19-21, което улеснява изучаването на заболявания като дисеминирана кандидоза, които са силно зависими от вродения имунитет. Малкият размер и прозрачност на ларвите на данио позволяват да се изобрази динамиката на инфекцията на клетъчно ниво, както за гостоприемника, така и за патогена. Трансгенните флуоресцентни имунни клетки на ларвите могат да се използват за идентифициране на специфични клетъчни типове, участващи в инфекция 22-24. Модифицираните антисенс олигонуклеотиди (Morpholinos) могат да бъдат използвани за унищожаване на различни имунни компоненти като фагоцитна NADPH оксидаза и изследване на промени в отговор на гъбична инфекция 5. В допълнение към практическите и етични предимства от използването на малък по-нисък гръбначен, рибните ларви Zebra предлага уникална възможност за представяне на разгърнатата битка между патогена и гостоприемника както интравитално, така и в цвят.

Zebrafish се използва за моделиране на инфекция за редица човешки патогенни бактерии и е допринесъл за важен напредък в нашето разбиране за микобактериална инфекция 3, 25. Въпреки това, наскоро много по-големи патогени като гъбички се използват за заразяване на ларви 5, 23, 26 и до момента няма подробно визуално описание на методологията за заразяване. Тук представяме нашите техники за микроинжектиране на заден мозък на заден мозък Prim 25, включително нашите модификации на предишни протоколи. Нашите резултати с модела на ларвите на зебра при гъбична инфекция се различават от проучванията in vitro и засилват необходимостта от изследване на взаимодействието гостоприемник и патоген в сложната машинна среда, а не в опростената система на Петри 5.

Протокол

Всички протоколи и експерименти за грижи за данио са извършени съгласно протокола за институционални грижи и заетост на животните (IACUC) A2009-11-01.

1. Морфолино и инжекционни ястия с ларви

Експериментална продължителност: * (10-15 минути)

Степен на трудност: *

  1. За инжекции с яйца пригответе 2% разтвор на агароза в стерилна вода и микровълнова фурна. Когато разтворът се охлади, изсипете част от него в допълнително дълбоко блюдо на Петри (Fisher Scientific), докато се напълни наполовина. Охладете се с лед и поставете чинията на нивото.
  2. След като плаката се охлади, се изсипва отгоре 15 ml слой 2% агароза. Напръскайте оребрена пластмасова форма за инжектиране на яйца (Adaptive Tools of Science) със стерилна вода от спрей бутилка. Внимателно поставете слота надолу в горещата агарозна форма. Когато агарозата се охлади, използвайте плоска метална шпатула (VWR Scientific), за да отделите шаблона от повдигнатия AGA. Постепенно отстранете решетката от агарозата. Увийте емблематичните съдове за инжектиране в Parafilm (VWR Scientific) и ги съхранявайте обърнати при 4 ° C.
  3. За инжекции с ларви на риби пригответе 2% разтвор на агароза, както е описано. Изсипете разтвора в чаша на Петри със стандартен размер (VWR Scientific) и оставете настрана, докато стане твърда. Увийте плочи с ларви за инжектиране на Parafilm и палатка, обърнати при 4 ° C.

2. Подготовка на гъбната култура

Експериментална продължителност: ** (30 минути)

Степен на трудност: **

3. Инфекции на данио

Експериментална продължителност: **** (1-3 часа)

Степен на трудност: ****

4. Подготовка на рибата в изображението

Експериментална продължителност: ** (30 минути)

Степен на трудност: **

  1. Пригответе разтвор на трикаин метан сулфонат както преди (200 mg/ml). Извадете заразените риби и ги прехвърлете в Tricaine.
  2. Пригответе 47,9 ml 0,4% агароза с ниско топене (VWR Scientific) в яйцето и водата. Загрейте разтвора в микровълновата печка. Охлажда се до 37 ° С и се добавя трикаин метан сулфонат (200 mg/ml) към сместа от
  3. След като рибите бъдат обездвижени в трикаин метан сулфонат, пипетирайте отделни риби в чаша на Петри (VWR Scientific), съдържаща 0,4% ниско топяща се агароза (VWR Scientific).
  4. След това преместете агарозната риба с ниска стопилка в отделни ямки на стъклена дънна плоча (MatTek Corporation) за изображения. Използвайте възможно най-малко агароза с ниска стопилка, за да могат рибите да лежат на дъното на капсулата. Използвайте само достатъчно количество трикаин-агароза, за да запълните вътрешните кръгове на стъклената дънна плоча.

5. Модификации, свързани с протоколите на Юпитер

Микропипети за микроинжектиране

Експериментална продължителност: * (10-15 минути)

Степен на трудност: *

  1. Издърпайте кухите стъклени пръчки BF120-69-10 (Sutter Instruments) с пламъчен кафяв микропипетен екстрактор Модел P-97 (Sutter Instruments) според Yuan et al. 30. Изберете програма # 7 със следните топлинни условия = 470, скорост = 120, време = 200. Получената игла е 8 мм от скоса до върха и, след като отрежете 3 мм над върха, имате диаметър около 10 микрона.
  2. Заредете стъклена микропипета върху държачите. Изберете "Издърпайте". Нагряващата нишка се нагрява към иглата в съответствие с програмните параметри и стъклената пръчка се разделя на две изтеглени микропипети. Съхранявайте микропипетите в кутия за съхранение на пипети (инструменти Sutter).

Събиране на ембриони, инжектиране и поддръжка на Morpholino

Експериментална продължителност: *** (1-2 часа)

Степен на трудност: ***

Експериментална продължителност: ***** (1-5 часа)

Степен на трудност: ***

6. Представителни резултати

Пример за успешен ромбенцефалонен вентрикул C. albicans в ларва на зебра при 5 часа след инфекцията (HPI) и HPI 24 е показан в (Фигура 1). Тъй като макрофагите-клетки, обгърнати от C. albicans, се виждат в задната камера на мозъка при 5 hpi. При 24 hpi, C. albicans се намира в макрофагите в гръбната тъкан на опашката, което е показателно за дисеминирана кандидоза. Този резултат от инфекцията силно зависи от точното инжектиране на 10-15 дрожди от форма C. albicans в задната камера на мозъка. Скринингът на заразени риби веднага след инжектирането може да осигури това.

дисеминирана

Фигура 1 FLI1 трансгенни:. EGFP 22, 33 ларви, заразени с CaF2-yCherry Candida albicans и интравитално изобразени чрез конфокална микроскопия. (CA) 5 часа след инфекция- (A) заразени с EGFP ларви-експресионни клетки на макрофаги на мястото на инфекцията (ромбенцефалонен вентрикул) Скала = 100 микрона. (B и C) Изображения с по-голямо увеличение на същите риби, показващи C. albicans, във фагоцитите. Скала = 100 μm за B и 10 μm за C. (DF) 24 часа след инфекция (D) ларва, заразена с дисеминирана кандидоза с CaF2-yCherry C. albicans вътре в EGFP макрофагоподобни клетки в гръбната опашка на тъканите. Мащабни ленти = 100 микрона. (E и F) Изображения с по-голямо увеличение на същата риба, показващи C. albicans в опашната тъкан. Мащабни ленти = 100 микрона.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Представеният тук метод за микроинжектиране на зебра се различава от Gutzman et al. 34, в която тук е демонстрирано инжектирането през ушния мехур в задната камера на мозъка на 36 до 48 HPF ларви. Описващ метод за последователно инжектиране на 10-15 дрожди в ромбенцефалоновата камера с намалено увреждане на тъканите. Този протокол произвежда локална инфекция, която първоначално се разпространява в тялото за 24 hpi. (Фигура 1) и резултатите от значителна леталност/заболеваемост 5. Задната камера на мозъка не е напълно затворена до 48 HPF 27, 29. По време на този първи етап на развитие макрофагите и неутрофилите мигрират към мястото на инфекцията, те фагоцитират C. albicans и може да премине към други части на тялото 5.

Истинската сила на тази система идва от способността да се комбинират трансгенни риби зебра с експресиращия микробите флуоресцентен протеин. Проектирахме диви и мутантни петна от C. albicans, за да изразим конститутивно mCherry, dTomato и eqFP650. Комбинацията от тези експресионни конструкции с промоторите на реакцията на оксидативен стрес позволява радиометричното количествено определяне на оксидативния стрес при живи ларви на риба зебра 5. Двойно in vivo изображение на флуоресцентни гъби и флуоресцентни вродени имунни клетки в контекста на гъбичен мутант или морфантна риба също може да бъде използва се за количествено определяне на силно променени имунни отговори като миграция към мястото на инфекцията, фагоцитоза на патогена, предотвратяване на покълването на гъбички и убиване на пет.

Към днешна дата ларвите на данио се използват за моделиране на вродения имунен отговор на бактериални патогени, гъбички и вируси 5, 26, 35-46. Тези новаторски проучвания са установили полезността на тази моделна система за откриване на нови клетъчни и молекулярни механизми, както в гостоприемника, така и в патогена. Във връзка с този описан протокол, тези други публикувани трудове служат като основа за други лаборатории да изследват взаимодействието гостоприемник-гъбички в контекста на непокътнат гостоприемник.

Въпреки че е полезна в тези експерименти, описаната тук трансгенна линия FLI1: EGFP има своите ограничения. Генът FLI1 се експресира в ендотелната васкулатура, в допълнение към макрофаги-клетки 22. Често флуоресценцията на съдов EGFP може да затрудни откриването на C. albicans в макрофаги-клетки. Освен това, експресията на EGFP в клетките на макрофагите се намалява около 18-24 часа след инфекцията, което затруднява откриването. Наскоро бяха публикувани специфични линейни макрофаги в трансгенните риби зебра и имат много предимства като модел за проучвания на макрофаги 23.

Описаната техника на заразяване осигурява достъп до редица мощни инструменти за генетична и флуоресцентна микроскопия, достъпни в рибите зебра. Може да се комбинира с подходящи трансгенни риби и изкуствени C. albicans, за да позволи количествено определяне на много аспекти на взаимодействието гостоприемник-патоген, включително броя на неутрофилите и макрофагите, съдържащи C. albicans, честотата на храносмилането на C. albicans и разделянето на C albicans, в рамките на имунните клетки 5. Този протокол може да се комбинира и с използването на морфолино антисенс олигонуклеотиди за тестване на ролята на всеки от вродените имунни гени в инфекцията чрез.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Разкриване

Няма декларирани конфликти на интереси.

Благодарности

Авторите биха искали да благодарят на лабораторията на д-р Карол Ким за обучение по микроинжектиране, Клариса Хенри за съвети относно ускоряване на развитието на ембрионите и използването на комплектите и Нейтън Лоусън за приноса на FLI1: EGFP риба. Благодарим на членовете на лабораторията Уилър и Шон Паредес за критичното четене на ръкописа. Също така бихме искали да благодарим на Марк Нилан за грижите и съветите за рибите, както и на Райън Феници и Габор Кристина за технически съвети по този проект. Тази работа беше подкрепена от MAFES Research Assistantship to Brothers K., MAFES Hatch Grant E08913-08 и награда NIH CNRR P20RR016463 на R. Wheeler.