ПОДГРАМНА СИСТЕМА ТЕХНИЧЕСКИ ФАКУЛТЕТ ЗА РАЗВИТИЕ Дипломна работа Преди получаване на магистърска степен ПО УСТОЙЧИВИ СИСТЕМИ ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА ЖИВОТНИ, ИМУНОГЛОБУЛИНИ И КАТО АЛТЕРНАТИВА НА АНТИБИООТЕРАПИЯТА ПРОТИВ Escherichia coli: Pedigo 23 април 2015 г. i

система

СЕРТИФИЦИРАНЕ НА СЛЕД ДИСЦИПЛОНЕНАТА СИСТЕМА Ние удостоверяваме, че тази работа е извършена изцяло от магистър Педро Пабло Седеньо Рейес като частично изискване за придобиване на академична степен на магистър по устойчиви животновъдни системи. Гуаякил, април 2015 г. ДИРЕКТОР НА ТЕЗАТА д-р Уилям Лопес Васкес. РЕЦЕНЗЕНТИ: Инж. Ноелия Кайседо Коело. Д-р Хосе Алварес Алварадо ДИРЕКТОР НА ПРОГРАМАТА инж. Джон Е. Франко Родригес. ii

ДЕКЛАРАЦИЯ ЗА ОТГОВОРНОСТ Pedro Pablo Cedeño Reyes ДЕКЛАРИРА, ЧЕ: Дипломният проект, наречен ИМУНОГЛОБУЛИНИ И, КАТО АЛТЕРНАТИВА НА АНТИБИОТЕРАПИЯТА ПРОТИВ ЕШЕРИЧИИ КОЛИ В ПРОИЗВОДСТВЕНИТЕ СИСТЕМИ НА ПИЛЕШКИ БРОЙЛЕРИ, е разработен на базата на интелигентни права, според интелектуални права цитатите, които се появяват на всяка съответна страница, чиито източници са включени в библиографията. Следователно тази работа е моя собствена. По силата на това твърдение, аз съм отговорен за съдържанието, достоверността и научния обхват на въпросния дипломен проект. Гуаякил, април 2015 г. АВТОРЪТ Педро Пабло Седеньо Рейес C.I. 1308992104 iii

РАЗРЕШЕНИЕ ЗА СЛЕДВАЩА СИСТЕМА I, Pedro Pablo Cedeño Reyes, упълномощава Universidad Católica Santiago de Guayaquil, публикацията в библиотеката на институцията на проекта, озаглавена: Имуноглобулините Y, като алтернатива на антибиотичната терапия срещу Escherichia coli в производствените системи на бройлери пилета, чието съдържание, идеи и критерии са моя единствена отговорност и авторство. Гуаякил, април 2015 г. АВТОРЪТ Pedro Pablo Cedeño Reyes C.I. 1308992104 iv

БЛАГОДАРЯ НА Католическия университет в Сантяго де Гуаякил. До Llaguno Cía. Ltda., За това, че ми позволихте да извърша тази изследователска работа в областта на животновъдството и върху притежаваните от тях имоти. На д-р Гонсало Лагуно Фигероа, който ме подкрепяше през цялото време по време на това разследване. Към Q.F. Сорая Тапия Бастидас, ръководител на производството в Laboratorios Llaguno. На д-р Педро Сакото. Производствен мениджър на Laboratorios Llaguno. На инж. Маркос Олгин Бургос. Началник отдел за техническа поддръжка. На д-р Анибал Робалино Робайо. Учител и приятел. На д-р Мауро Лоор Макиас. Учител и приятел. На нашите професори с обич, уважение и възхищение. v

ИНДЕКС ГЛАВА СЪДЪРЖАНИЕ СТРАНИЦА. 1. ПОДХОД. 1 1.1. ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ ... 1 1.2. Описание на обекта на разследването. 3 1.3. Обосновка. 4 1.4. Изследователски въпроси. 6 1.5. Цели. 7 1.5.1. Общ. 7 1.5.2. Конкретни . 7 2. ТЕОРЕТИЧНА РАМКА. 8 2.1. Колибактериоза. 8 2.1.1. Честота и разпространение. 9 2.1.2. Етиология и патогенеза. 10 2.1.3. Клинични находки и лезии . 14 2.1.4. Диагноза. 15 2.1.5. Зооноза. 17 2.1.6. Лечение. 20 2.1.7. Предотвратяване. 21 2.2. Антимикробна резистентност на бактериите 22 2.3. Алтернативни лечения на ентериални инфекциозни проблеми ... 25 2.3.1. Етерично масло от растението риган. 25 2.3.2. Използване на имуномодулатори 26 2.3.3. Пребиотици и пробиотици . 27 2.3.4. Фитогенни хранителни добавки (PFA). 28 2.3.5 Органични киселини 28 2.3.6. Употреба на имуноглобулини Y. 29 2.4. Имуноглобулин Y, от яйчен жълтък. 30 vi

2.4.1. Специфичност на IgY. 33 2.4.2. Прехвърляне на IgY в яйцеклетката 34 2.4.3. Екстракция и изолиране на IgY от яйчен жълтък. 35 2.4.4. Използване и предимства на IgY . 36 2.4.5. Използване на имуноглобулини Y при диагностични имуносерологични тестове 38 2.5. Титруване на вируси или бактерии 39 2.5.1. Квалификации. 39 2.5.2. Видове степен. 2.6. Прилагане на ваксини. 43 2.7. Културни медии . 43 2.7.1. Класификация на културните среди. 44 2.7.1.1. Културни среди според тяхната консистенция 44 2.7.1.2. Културни среди според тяхното предназначение . 45 2.7.2. Търговски културни медии. 46 2.7.2.1. Културна среда L.B. (Лурия Бертани) или Агар Милър. 46 2.7.2.2. Триптична соева култура (TSB) хранителна среда. 47 2.7.2.3. MacConkey Agar Medium 48 2.7.3. Подготовка на културни медии . 49 2.7.3.1. Подготовка на разтвора 49 2.7.3.2. Стерилизация 50 2.7.3.3. Изливане на чинии . 50 3. МЕТОДОЛОГИЯ. 51 3.1. Фокус. 51 3.2. Вселената. 52 3.3. Местоположение на изследването . 53 3.4. Оборудване и материали. 54 3.4.1. Лабораторни материали 54 3.4.2. Полеви материали 55 3.5. Изследвани променливи. 56 vii

3.5.1. Изследователски променливи или категории 56 3.5.2. Измерване на променливи. 56 3.5.2.1. Заболеваемост 56 3.5.2.2. Смъртност. 57 3.5.2.3. Разходи за лечение 57 3.6. Методи . 57 Описание на работата . 57 3.6.1. Изолиране и секвениране на Е. coli . 58 3.6.2. Титруване на бактериите E. coli 58 3.6.2.1. Подготовка на хранителни среди 58 3.6.2.2. Сеитба на Е. coli и инкубация в продължение на 18 часа 60 3.6.2.3. Първо разреждане на Е. coli (разреждане 1 на 10) и инкубация в продължение на 18 часа. 60 3.6.2.4. Второ разреждане на Е. coli (разреждане 1 на 100) и инкубация в продължение на 4 часа. 61 3.6.2.5. Инокулация на Е. coli в твърда среда и при еднодневни пилета 61 3.6.2.6. Период на наблюдение. 61 3.6.2.7. Конфронтация на имуноглобулини с вече титрувани бактерии. 62 3.6.2.8. Процедури за събиране на данни. 63 3.6.3. Статистически изследвания 65 3.6.4. Работен план. 66 4. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ. 67 5. ЗАКЛЮЧЕНИЯ. 76 6. ПРЕПОРЪКИ . 77 БИБЛИОГРАФИЯ. 78 ПРИЛОЖЕНИЯ 89 viii

ИНДЕКС НА ТАБЛИЦИТЕ СЪДЪРЖАНИЕ СТРАНИЦА. Таблица 1 Ефективност на имуноглобулин Y срещу предизвикателството с 1 LD 50% от Е. coli и сравнение на фактора за преобразуване на храната (FC) на ден 7 след инокулация. 35-дневна . 68 Таблица 2 Сравнение на коефициента на преобразуване на фуража (F.C) в ден 13 след инокулацията. 41 дни . 70 Таблица 3 Безопасност на имуноглобулините, приложени към пилета Ross 308. 72 Таблица 4 Сравнение на разходите за лечение. 73 ix

ИНДЕКС НА ГРАФИКА СЪДЪРЖАНИЕ СТРАНИЦА. Графика 1 Ефективност на обработките по отношение на натрупания FC. 71 х

ИНДЕКС НА ФИГУРИТЕ Фигура 1 Фигура 2 Местоположение на кантон Lomas de Sargentillo, провинция Guayas. 89 Засяване на E coli в течна среда (TSB) 89 Фигура 3 Направяне на разреждания на E Coli за получаване на LD50. 90 Фигура 4 Колонии на E coli на MacConkey Agar. 90 Фигура 5 Фигура 6 Фигура 7 Инокулация на E. Coli при еднодневни пилета, за да се получи LD 50. 91 Група пилета, инокулирани с E coli при разреждане 10-10. 91 Събиране на данни за определяне леталността на E Coli при еднодневни пилета 92 Фигура 8 Приложение на IgY директно върху поилката 92 Фигура 9 Приложение на E Coli. 93 Фигура 10 Специална спринцовка, използвана за инокулиране на E coli 93 xi

произвеждат, като същевременно намаляват количеството химикали от всякакъв вид, използвани в птицевъдството. Намаляването на производствените разходи в птицевъдната промишленост ще бъде по-голямо, ако се намали консумацията на антибиотици, тъй като големият внос на тази суровина ще намалее, генерирайки увеличение на печалбите, увеличавайки активността на птицевъдството и в същото време подобрявайки еквадорската птицевъдна инфраструктура. 5

1.4. Въпроси за изследване Може ли IgY да бъде полезен за контролиране на ефектите на E.coli в птицевъдната индустрия? Ще бъде ли безопасно използването на IgY в интензивни системи за производство на пилета-бройлери? на птиците? IgY може да бъде алтернатива за имунотерапия 6

1.5. ЦЕЛИ 1.5.1. Общи положения За оценка на употребата на имуноглобулини в контрола на Е. coli агент, който засяга системите за производство на пилета-бройлери. 1.5.2. Специфично 1. Да се ​​определи ефикасността на имуноглобулините срещу предизвикателствата на Е. coli при пилета-бройлери. 2. Анализирайте безопасността на употребата на имуноглобулини в интензивни производствени системи за пилета-бройлери. 3. Извършете анализ на разходите за лечение с имуноглобулин спрямо лечение с антибиотици. 7

вирулентен, който е причинил важни ефекти върху здравето на жителите на тези нации (EFSA, 2014). 2.1.6. Лечение Според Stanchi (2007), управлението и условията на околната среда, на които са изложени засегнатите животни, ги правят по-податливи на Е. coli, безразборната употреба на лекарства е причинила развитието на резистентност. Сред антимикробните средства, които показват активност срещу тези микроорганизми, са комбинацията от сулфаметоксазол + триметопин, гентамицин и хлорамфеникол. Páez и Ocampo (2005) посочват, че лечението на E.coli е: a. Лечение в храните Фуразолидон 400 ppm за 5 дни като лечебна мярка. Оксолинова киселина при 150 ppm за 5 до 7 дни. Хлортетрациклин 400 ppm за 5 до 7 дни като лечебна мярка. Окситетрациклин 400 ppm за 5 до 7 дни като лечебна мярка. Амоксицилин 192 ppm за 5 дни като лечебна мярка. Сулфадиметоксин 120 ppm + триметоприн 30 ppm за 5 до 7 дни като лечебна мярка. Сулфахлоропиридазин 150 до 300 ppm + Trimethoprin 30 до 60 ppm за 7 дни като лечебна мярка. Фосфомицин в дози от 10 до 40 mg/kg. Еритромицин 200 ppm + Колистин 20 ppm за 5 до 8 дни като лечебна мярка. двайсет

Според Pérez (2009) биозидното или биостатичното действие на органичните киселини се проявява по два различни начина: Те се намесват в метаболизма на въглехидратите в клетъчната стена на микроорганизмите, където различни ензими се блокират, така че те да умрат. Микроорганизмите се размножават по-добре при рН, което е близо до неутрално, така че чрез подкисляване на храната чрез добавяне на органични киселини е възможно да се ограничи бактериалният растеж. 2.3.6. Употреба на имуноглобулини Y В различни населени места на нашата планета са проведени множество изследователски работи, за да се потвърди ползата от имуноглобулините за здравето на домашните животни, като тези работи са проведени експериментално в лаборатории и при нормални условия на боравене в конюшни за производство на млечни продукти. форми: В работа, извършена в плевня, се прилага IgY на две а) Млечни заместители, към които се добавя порция яйчен жълтък на прах, който идва от хиперимунизирани кокошки. б) Директно администриране на цяло яйце, източникът не уточнява дали е зашито или сурово. 29

- Имуноблот. Вторични тестове. - Валежи. - Аглутинация. - Фиксиране на комплемента. Третични тестове. - Реакция на неутрализация. - Защита. 2.5. Титруване на вируси или бактерии Титруването на вируси и бактерии и метода на Рийд и Муенч, цитирано от López (2010). Титруването на вируса се използва за определяне на количеството на вируса в суспензия. За титруване на вирус се правят разреждания, за да се определи най-високото разреждане, което води до желания ефект, например: Искам да знам до кое разреждане вирусът убива, парализира, произвежда цитопатичен ефект, наред с други 2.5.1. Титриране Стъпки за извършване на титруването: Направете разреждания: най-използваните са: Разреждане в основата 2. В няколко епруветки (те трябва да бъдат номерирани) поставете 1 ml от разредителя (физиологичен разтвор). По-късно отнема 39

1 ml от вируса от някаква проба майка и го добавете към епруветка номер 1 (разреждане 1: 2). След това от първата епруветка се взима 1 ml и се добавя към втората епруветка (разреждане 1: 4) и така се правят разрежданията. Следователно в крайна сметка винаги ще имаме 1 ml обем във всяка туба, а това, което ще варира, ще бъде разреждането. 1 ml AAAA разреждане в основа 10. В няколко епруветки (номерирани) се поставят 9 ml разредител (физиологичен разтвор), след това 1 ml от вируса се взема от някаква майчина проба и се поставя в епруветка номер 1 (разреждане 1: 10) . След това от първата епруветка се взима 1 ml и се добавя към втората епруветка (разреждане 1: 100) и така се правят разрежданията. (1/10 = 10-1; 1/100 = 10-2; 1/1000 = 10-3; 1/10000 = 10-4). 2.5.2. Видове титруване Вирусното титруване се използва за определяне на количеството на вируса в суспензия. 100% инфекциозно заглавие. При това биологично количествено определяне крайната точка обикновено се разглежда като максимално разреждане, което води до този ефект. 100% крайна точка може да се изчисли при максималното разреждане, което води до очаквания ефект при 100% от инокулатите, не е много точно и рядко се използва. 40

50% инфекциозно заглавие. Повечето лаборатории използват 50% крайна точка, която би била максималното разреждане, засягащо поне 50% от инокулатите. Изразява се също като 50% летална доза (LD50) или 50% инфекциозна доза (ID50). Най-добрият начин да се определи тази крайна точка е да се използват голям брой животни и близки разреждания. Правят се серия разреждания на микроорганизма (или серум, ако искате да титрирате серума, за да се знае нивото на антителата) и всяко разреждане се инокулира в малка група от биологичния субстрат, който ще се използва (клетки, отглеждани в епруветки, микроплаки, ембрионирани яйца, мишки, наред с други) обикновено 6 до 8 единици за разреждане. Reed and Muench през 1938 г., цитиран от López (2005), проектира метод за оценка на 50% крайна точка на инфекциозни дози, които се използват във всички лаборатории. Като пример се предлага следното упражнение: Правят се разреждания на база 10, обикновено 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10 -9, наред с други. Избират се четири или пет разреждания за инокулиране, като се използват например 6 мишки на разреждане. Ако приемем, че мишките умират, както следва: 10-3 6 инокулирани и 6 мъртви 10-4 6 инокулирани и 6 мъртви 10-5 6 инокулирани и 4 мъртви 10-6 6 инокулирани и 1 умрели 10-7 6 инокулирани и 0 мъртви 41

Подреждане на смъртността от разреждане на данните Пропорция Dead Alive Dead Alive% 10-3 6/6 6 0 17 0 17/17 100 10-4 6/6 6 0 11 0 11/11 100 10-5 4/6 4 2 5 2 5/7 71 10-6 1/6 1 5 1 7 1/8 13 10-7 0/6 0 6 0 13 0/13 0 Колоната за сумиране на смъртните случаи се формира чрез добавяне отдолу нагоре, тъй като при долната разреждания ще има по-висока смъртност и колоната за сумиране на живите ще се извършва чрез добавяне отгоре надолу, тъй като колкото по-голямо е разреждането, толкова по-голям е броят на живите. За определяне на титъра се взема за основа разреждането, което показва процента на смъртност непосредствено по-висок от 50%, в този пример ще бъде 10-5. 50% ще бъде между това разреждане и следващото и пропорционалното за достигане на 50% се изчислява по следната формула: (% незабавна смъртност> 50%) (50) (% непосредствена смъртност> 50%) (% непосредствена смъртност