канал

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Функционално изразяване на TRPM8 в популации от макрофаги
  • TRPM8 модулира експресията на цитокини в макрофаги
  • TRPM8 модулира фагоцитната активност и подвижността на макрофагите
  • Роля на TRPM8 в макрофаги в контекста на възпалението
  • Дискусия
  • Методи
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълващи се легенди за фигурата
  • Допълнителни фигури
  • Допълнителни методи

Субекти

  • Клетъчна смърт и имунен отговор
  • Колит
  • Моноцити и макрофаги
  • Преходни потенциални канали на рецептора

Обобщение

Въведение

По отношение на макрофагите вече е показано, че няколко TRP канала получават сигнали, важни за функцията на макрофагите. Например, макрофагите с дефицит на TRPC3 показват повишена апоптоза и променена ефероцитоза, 9 и повишено регулиране на TRPC6 се наблюдава в човешки алвеоларни макрофаги от пациенти с хронична обструктивна белодробна болест. 10 В миши перитонеални макрофаги (PM), TRPV2-медиирано свързване на частици и фагоцитоза са замесени в индуцираната от липополизахарид (LPS) продукция на цитокини, докато TRPV4 +/+ макрофагите възстановяват чувствителността на белите дробове към TRPV4 -/- към механични повреди, причинени от вентилатора. 11, 12

Тук демонстрираме, че активирането на конститутивно експресиран TRPM8 в миши макрофаги индуцира противовъзпалителен цитокинов профил и увеличава фагоцитозата, докато генетичното делеция или фармакологичното блокиране на TRPM8 предизвиква противоположни ефекти. В съответствие с тези констатации, ментоловите клизми са били защитни при мишки от див тип (WT) с експериментален колит, независимо от модулацията на освобождаването на невропептиди, докато мишките с дефицит на TRPM8 показват влошен колит. Мишките, възстановени с TRPM8-дефицитни макрофаги, постоянно показват повишена чувствителност към колит, демонстрирайки критична роля за конститутивната експресия на TRPM8 във вродения имунитет. Установено е, че провъзпалителните ефекти на макрофагите с дефицит на TRPM8 зависят от дисбаланса на фактора туморна некроза α (TNF) -α и производството на интерлевкин (IL) -10 in vitro и in vivo .

Резултати

Функционално изразяване на TRPM8 в популации от макрофаги

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд PowerPoint

TRPM8 модулира експресията на цитокини в макрофаги

TRPM8-медиирана модулация на експресията на цитокини в миши перитонеални макрофаги (PM). Освобождаване на TNF-α ( да се ) и IL-10 ( б ) от див тип (WT) и TRPM8-дефицитен (KO) PM след 8 h стимулация с LPS (100 ng ml -1) без или без ментол (100 μM). Активирането на TRPM8 инхибира TNF-α, но засилва освобождаването на IL-10 в WT, но не и PM с дефицит на TRPM8. Данните идват от три експеримента (средно и полу от четири мишки за генотип, анализирани в три екземпляра. * P

Ментоловите клизми предпазват мишки от див тип WT C57BL/6 от DSS колит (2%). ( да се ) Мишките, които са били лекувани с ментолови клизми два пъти дневно (100 µM), само са загубили малко тегло по време на DSS колит в сравнение с контролите на носителя. Данните са представителни за три експеримента, всяка група n = 6. * P 3,5 След това измерихме освобождаването на CGRP от дебелото черво, изолирано от здрави и колитични мишки (допълнителна фигура S5). TRPM8 агонистите ментол (100 µM) и ицилин (33 µM) инхибират механично индуцирано освобождаване на CGRP (90 mm Hg) в здравото дебело черво до приблизително същата степен, и двете, без да оказват присъщи ефекти върху освобождаването на CGRP. Интересното е, че освобождаването на CGRP от дебелото черво, предизвикано от разтягане на възпаленото дебело черво (2% DSS колит), е силно отслабено само по себе си, което предполага изчерпване/десенсибилизация на пептидергичните сензорни неврони. Нито един от TRPM8 агонистите не проявява ефект върху механично индуцирано освобождаване на CGRP при това условие.

За по-нататъшно изследване на общата роля на TRPM8 при възпаление на дебелото черво, индуцирахме DSS колит при WT и TRPM8 KO мишки. Както се определя от същите скринингови инструменти, както преди, мишките TRPM8 KO показват повишена чувствителност към колит (Фигура 5). В сравнение с контролните WT мишки, TRPM8 KO мишките загубиха повече тегло (Фигура 5а) и по-голям брой нокаутиращи мишки умряха по време на 7-дневния курс на DSS колит (Фигура 5b). TRPM8 KO мишките също показаха по-голямо ендоскопско увреждане (Фигура 5c) и по-тежки хистологични промени (Фигура 5d) в сравнение с контролните WT мишки.

Влошен DSS колит (2%) при мишки с дефицит на TRPM8 (KO) в сравнение с мишки от див тип (WT). ( да се ) Загубата на тегло при мишки с дефицит на TRPM8 е по-тежка в сравнение с контролните WT мишки по време на DSS колит в този отделен експеримент. Данните са представителни за три експеримента, всяка група n = 6. * P

В обобщение, нашите открития идентифицират TRPM8 като потенциална цел при възпалителни състояния, които обикновено включват функция на макрофагите (напр. Микробни инфекции) и по-специално, включително лечението на възпалителни заболявания на червата. Клиничните изпитвания, при които се използват клизми или перорални препарати на TRPM8 агонисти като ицилин, ментол и евкалиптол, трябва да бъдат ясни, тъй като при тези средства не са докладвани тежки странични ефекти. 42 Освен това лекарствата на базата на мента вече се използват от пациенти със синдром на раздразнените черва поради техните аналгетични, спазмолитични и карминативни ефекти; пациенти с възпалителни заболявания на червата също могат да се възползват от тези ефекти.

Методи

За подробности вижте Допълнителните методи.

Животни. WT и TRPM8-мутант (B6.129P2-Trpm8 tm1Jul/J, лабораторията Джаксън, Бар Харбър, МЕ) 43 Мишки C57BL/6 от двата пола бяха използвани на възраст 8-12 седмици. Всички експерименти с животни са одобрени от Органа за защита на животните, областно правителство Mittelfranken, Ansbach, Германия.

Изолиране на миши PM и макрофаги, получени от костен мозък. За подробности относно подготовката и изолирането на клетките вижте допълнителните методи. Както беше описано по-горе, процедурите гарантираха, че> 99% от прикрепените клетки са F4/80 + макрофаги. единадесет

Анализ на фагоцитоза. Изследователят, който определи количествено фагоцитната активност във всички групи, беше заслепен за генотипове и процедури за лечение. In vitro фагоцитозата се оценява с помощта на частици zymosan или Citrobacter rodentium; in vivo са използвани флуоресбритни микрочастици (0,5 μl g -1, Polysciences, Eppelheim, Германия) за оценка на фагоцитозата.

Рациометрични [Ca 2+] i измервания. Рациометричните [Ca 2+] i измервания на култивирани миши PM и BMDM, използвайки Fura-2 (5 μmol l -1), по същество се извършват, както е описано по-горе по отношение на невроните. 6 6

Индукция на DSS колит, мониторинг и фармакологично лечение. Колитът се индуцира чрез добавяне на 2% DSS (молекулно тегло: 36 000–50 000 kDa; MP Biomedicals, Illkirch, Франция) към питейната вода за 1 седмица, както е описано по-горе. 6 Оценяването на ендоскопски колит се извършва, както е описано по-горе, като се използва миши ендоскопски индекс на тежест на колита (ендоскопски резултат), състоящ се от пет параметъра: консистенция на изпражненията, гранулиране на повърхността на лигавицата, видим фибринов ексудат, промени в съдовия модел и едематозно удебеляване на стената на дебелото черво, придружено от загуба на прозрачност. 44 Всеки параметър е класиран от 0 точки (няма) до 3 точки (тежко).

In vivo изчерпване на макрофаги, осиновително прехвърляне и възстановяване. Този метод е описан първоначално от Van Rooijen и Sanders. Четири пет

In vivo свръхекспресия на IL-10. Експресионна конструкция за поддържана in vivo експресия на IL-10 се генерира чрез клониране на комплементарен ДНК (cDNA) фрагмент, кодиращ миша пълна дължина cDNA в AAV вирус, както е описано по-горе. 46 ДНК се изолира с помощта на Qiagen плазмидни макси комплекти, които включват етап на отстраняване на ендотоксин. Впоследствие ДНК се третира с комплект за отстраняване на ендотоксини MiraClean (Mirus Bio, Madison, WI). За лечение, 10 μg конструкция са приложени в разтвор на Krebs - Ringer на всяка мишка чрез хидродинамична инжекция на опашната вена, както е описано по-горе. 47 Контролни мишки получиха контролен плазмид, който не кодира IL-10 (фалшив).

Откриване на реактивни кислородни видове. Системата за сканиране на флуоресценция на цялото тяло MAESTRO (INTAS, Гьотинген, Германия) е използвана за in vivo мултиспектрален флуоресцентен анализ, както е описано наскоро. 43 ROS откриване беше извършено с използване на ROS Brite 700 nm багрило, съгласно указанията на производителя (AAT Bioquest, Сънивейл, Калифорния).

Анализ на данни. Числото (n) се отнася до броя на изследваните животни или клетки. Изчисленията бяха извършени с помощта на Statistica 7.0 (Statsoft, Tulsa, OK) и Origin 7.0 (OriginLab, Northampton, MA). Използваните тестове са обозначени в текста и/или легендите на фигурите.