Обобщение
Резюме
Въведение
Клетките на нервния гребен (NC) се появяват по време на неврулация на гръбначни животни между епидермиса и невронния епител. Те се размножават и мигрират широко в развиващия се ембрион и пораждат впечатляващо разнообразие от видове потомствени клетки, включително кости/хрущяли, черепно-лицеви скелети, сензорни нерви, клетки на Шван, меланоцити, гладки мускулни клетки, чревни неврони, автономни неврони, хромафинови клетки, сърдечни преградни клетки, зъби и клетки на надбъбречната жлеза/щитовидната жлеза 6. Следователно, NC клетките са привлекателен клетъчен тип за полето на стволовите клетки и са важни за моделирането на редица заболявания, като болестта на Hirschsprung 7, фамилна дисавтономия 8, т.к. както и ракови заболявания като невробластом 9. Освен това те предлагат възможност за изучаване на аспекти на човешкото ембрионално развитие in vitro.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
1. Подготовка на хранителни среди, покрити плаки и поддържане на hPSC
Подготовка 1.1 Среда
Забележка: всички филтриращи среди за стерилизация и се съхраняват при 4 ° C на тъмно до 2 седмици. Номерата на имената на реагенти за компанията и каталога са посочени в Таблица на материалите.
- DMEM/10% FBS: Комбинирайте 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml пеницилин/стрептомицин и 5 ml L-глутамин.
- HES-среда: Комбинирайте 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-глутамин, 5 ml пеницилин/стрептомицин, 10 ml минимален разтвор на незаменими аминокиселини MEM, 1 ml β-меркаптоетанол. Добавете 10 ng/ml FGF-2 след филтриране на средата.
ВНИМАНИЕ: β-меркаптоетанолът е токсичен, избягвайте вдишване, поглъщане и контакт с кожата. - KSR-диференцираща среда: Комбинирайте 820 ml нокаут DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-глутамин, 10 ml пеницилин/стрептомицин, 10 ml MEM минимален разтвор на незаменими аминокиселини и 1 ml β-меркаптоетанол.
- N2-диференцираща среда: Разтворете 12 g прах в 980 ml DMEM/F12 dH 2 O, добавете 1,55 g глюкоза, 2 g натриев бикарбонат и 100 mg APO човешки трансферин. Смесете 2 ml dH2O с 25 mg човешки инсулин и 40 µl 1 N NaOH, добавете разтворения разтвор към средата. Добавете 100 l путресцин дихидрохлорид, 60 l селенит, 100 l прогестерон и донесете обема до 1 литър с dH 2 O.
1.2 Покривни културни плочи
1.3 Поддръжка на hPSC
Забележка: hPSCs се поддържат в 0,1% желатин и митотично инактивирани миши ембрионални фибробласти (MEFS) в HES-среда, допълнена с 10 ng/ml FGF-2, както е описано по-горе 10,12. Клетките трябва да се разделят на всеки 6-8 дни.
- Покрийте 10 cm съд с 8 ml 0,1% желатин (в 1x PBS без магнезий или калций) при RT за 5 минути.
- Размразете бързо замразените MEFs на водна баня с температура 37 ° C. Добавете 1 милион MEFs към 10 ml DMEM/10% FBS.
- Аспирирайте желатина и покрийте клетките. Инкубирайте при 37 ° С за поне 6 часа.
- Аспирирайте DMEM/10% FBS от подготвената MEF плака, измийте плаката с 1x PBS веднъж и добавете 10 ml HES-среда, допълнена с 10 mM Y-27632 дихидрохлорид. Оставете средата да се затопли до 37 ° C за 20 минути.
Забележка: За ръчно разделяне на hPSC се използва качулка с ламинарен поток с вграден микроскоп. Клетките обаче могат да бъдат преминавани чрез подходящи алтернативни методи. - Под качулка с ламинарен поток с вграден микроскоп отделете отделни колонии с помощта на мобилен кран и им позволете да плават.
- Използвайте спринцовка от 1 ml, за да аспирирате плаващите колонии и да ги изпратите в хладната, топла MEF чиния. Прехвърлете около една четвърт от клетките в новия съд. Инкубирайте при 37 ° C.
- Хранете клетките ежедневно с прясна HES среда.
2. Покриване на hPSC за диференциация
Забележка: hPSCs трябва да се разделят или покрият за диференциация, когато колониите са големи, но все още имат остри ръбове с възможно най-малко клетки, които се диференцират на границите си Фигура 1Б). Когато клетките се поддържат с ръчно преминаване, колониите трябва да са достатъчно големи, за да се виждат лесно от окото. За да получите правилното усещане за този момент във времето, можете да запазите отделна HPSC плоча за две седмици без преминаване и да наблюдавате как клетките достигат и преминават идеалната времева точка за преминаване/диференциация.
3. Индукция на невронална диференциация
Забележка: Диференциацията може да започне (ден 0), когато клетките се сливат на 90-100% (вж Фигура 1В), обикновено на следващия ден. Ако не се достигне точно сливане обаче, клетките могат да се хранят ежедневно с HES-среда, докато не са готови за диференциация. Алтернативно, първоначалният брой засети клетки може да бъде увеличен.
- На ден от 0 до 3, хранете клетки ежедневно с 10 ml/10 cm KSR-диференцираща среда, съдържаща 0,1 μM LDN193189 и 10 M SB431542.
- На ден 4 и 5 захранвайте клетките със 75% KSR-диференцираща среда и 25% N2-диференцираща среда, и двете съдържащи LDN193189 и SB431542.
- На 6 и 7 ден захранвайте клетките с 50% KSR-диференцираща среда и 50% N2-диференцираща среда, и двете съдържащи LDN193189 и SB431542.
- На 8 и 9 ден хранят клетките с 25% KSR-диференцираща среда и 75% N2-диференцираща среда, и двете съдържащи LDN193189 и SB431542.
- На 9 и 10 ден се приготвят ястия PO/Lam/FN, както е посочено в точка 1.2.2, за подмяна на клетките на ден 11.
- На 10-ия ден се захранват клетки с N2-диференцираща среда, съдържаща LDN193189 и SB431542.
4. Презареждане на капки по NC спецификации
5. Флуоресценция на сортирани активирани клетки (FACS) на NC клетки
Забележка: Подготовката на клетки за FACS изисква приблизително 2 часа.
6. Подмяна на класифицирани клетки, NC поддръжка и разширяване
Забележка: сортираните FACS клетки трябва да се провеждат с особено внимание, за да се осигури оптимално оцеляване. Дръжте ги на лед, докато не ги поставите отново. Не разклащайте и не пипетирайте силно. Клетките могат да бъдат ресуспендирани чрез задействане на тръбата.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
Фигура 2. Сравнима идентичност на клетките на невронния гребен на клетки, получени с протокола MS5-R-NC или R-NC. И в двата протокола клетките преминават през невронално розетно състояние. Подредените NC клетки изглеждат идентични по морфология и по експресията на NC маркери като HNK-1 и AP-2. NC клетките са нестин-положителни, което показва, че те са предшественици. Мащабна лента: 200 m. Всички флуоресцентни изображения бяха оцветени за DAPI. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Дискусия
За всички HPSC полеви приложения е изключително важно да има точни, възпроизводими, дефинирани и специфични протоколи за диференциация in vitro. В този доклад ние показваме адаптацията на in vitro протокол, установен в диференциация за получаване на R-NC клетки от hPSCs. Отчетеният протокол създава същите клетки, както преди докладваните 10 при по-дефинирани условия на отглеждане и по-кратка времева рамка. Този протокол може да се използва за генериране на R-NC клетки за човешки заболявания, засягащи клетки от Северна Каролина, за изследвания на съединения, токсикологични тестове и разработване на протоколи за диференциация, насочени към клетъчни типове, получени от NC линия.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Разкриване
Авторите нямат конфликт на интереси за разкриване.