възпаление

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • TNBS причинява колит и увреждане на паметта при мишки
  • EC лошо обучение и увреждане на паметта при мишки
  • LJ отслабва TNBS или EC-индуциран колит и увреждане на паметта при мишки
  • TNBS и EC променят състава на чревната микробиота
  • LPS, изолиран от ускорено увреждане на паметта на EC при мишки
  • Дискусия
  • Методи
  • Присъединяване
  • Файл за четене на последователност
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителна информация

Субекти

  • Имунна памет
  • Инфекция
  • Възпалително заболяване на червата
  • Микробиота

Обобщение

Въведение

Обширни и интензивни двупосочни мрежи между чревната микробиота и централната нервна система (ЦНС) се поддържат чрез ендокринни, невронни и имунни пътища. 1, 2 Излагането на стрес, като патогени, стимулира мозъка да отделя хормони като освобождаващ кортикотропин фактор, през оста хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза, които нарушават чревната микробиота, пропускливостта и бариерната функция и увеличават производството ендотоксини като липополизахариди (LPS). 3, 4 Освен това, тези ендотоксини, които са части от бактериални химични съставки, стимулират чревния имунен отговор и ограничават секрецията на невротрансмитерите серотонин и катехоламини. 5, 6, 7 Тези невротрансмитери, цитокини и хормони подпомагат комуникацията между чревната имунна система (свързана с чревната микробиота) и ЦНС и поддържат хомеостазата. 5, 6 Дисрегулирането на тези сигнали води до колит, аутизъм и затлъстяване. 8, 9

В това проучване, тъй като стресът може да предизвика нива на LPS чрез колит и тъй като LPS може да повлияе на функциите на ЦНС, тествахме нашата хипотеза, че индукторите на колит могат да причинят стомашно възпаление и увреждане на паметта, като променят състава на чревната микробиота, и изследвахме дали колебанията в състава на чревната микробиота от индуктора на колит може да потенцира колит и увреждане на паметта при мишки.

Резултати

TNBS причинява колит и увреждане на паметта при мишки

L. johnsonii (LJ) отслабва индуцирания от колит 2,4,6-тринитробензенсулфонова киселина (TNBS) колит и увреждане на паметта. Поведението на обучение и памет бяха оценени в задачата Y-лабиринт ( да се ). Експресията на невротрофичен фактор, получен от мозъка (BDNF) и активирането на ядрения фактор (NF) -κB бяха измерени в хипокампуса с помощта на имуноблотинг ( б ). Нивата на липополизахарид в кръвта (LPS) бяха измерени с помощта на анализа Limulus ( ° С ). Нива в кръвта ( д ) и хипокампален тумор некрозис фактор (TNF) -α ( и ) бяха измерени с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Маркери на колит, включително съкращаване на дебелото черво ( F ), активност на миелопероксидазата на дебелото черво (MPO) ( ж ) и активиране на NF-кВ и индуцируема експресия на азотен оксид синтаза (iNOS) и циклооксигеназа (COX) -2 ( з ) и експресията на здраво свързващ протеин (i) бяха измерени в дебелото черво. Стойностите показват средната стойност ± sd (n = 10). * Р

Ефекти на 2, 4, 6-тринитробензенсулфонова киселина (TNBS), Е. coli (EC) и L. johnsonii (LJ) върху състава на чревната микробиота при мишки. Ефект върху типа ( да се ) и семейни нива ( б ). Съотношенията между протеобактериите и твърдите вещества (P/F) ( ° С ), Bacteroidetes to Firmicutes (B/F) ( д ) и Proteobacteria a Bacteroidetes (P/B) ( и ), бяха анализирани чрез секвениране на бактериалните 16S рРНК фрагменти ( д ) ( F ) Диаграма на главния координатен анализ (PCoA). Графиката показва модела на клъстериране между мишки, третирани само с носител (NOR), само с TNBS, само с EC, LJ в присъствието на EC (EC + LJ) въз основа на двойно претеглен Fast UniFrac анализ. Ефектът върху броя на Enterobacteriaceae ( ж ) и бифидобактерии + лактобацили ( з ) се измерва като се използва селективна медийна култура. Черните, сивите и белите ленти в ( ж ) посочват състава на EC, K. pneumoniae и P. mirabilis, съответно. Стойностите показват средната стойност ± sd (n = 5). * Р

Методи

Култура на чревни бактерии. LJ и EC, изолирани от чревна микробиота на мишка, се култивират в GAM бульон (BD, Radnor, PA) и селективна среда MRS (BD), BL и DHL (Nissui Pharm, Токио, Япония). Накратко, LJ и EC се култивират в 0,5 μl GAM бульон при 37 ° С (оптична плътност при 600 nm, 1,0-1,2), събират се чрез центрофугиране (5 000 g за 20 минути) и се промиват с два пъти физиологичен разтвор. Събраните клетки (5 х 109 CFU ml -1) се суспендират във физиологичен разтвор (за клетъчни експерименти, нагрява се при 72 ° С в продължение на 30 минути) или 1% глюкоза (за орално приложение на мишки).

За анализ на чревната микробиота чрез селективна среда, съдържанието на прясно дебело черво (∼ 0,1 g) се събира от всяка група в стерилизирани пластмасови чаши, внимателно се суспендира в 9 обема среда за разреждане, постепенно се разрежда 10 пъти и се инокулира директно върху плочи с агар с кръвна чернодробна среда (BL, Bifidobacteria/Lactobacillus селективна среда, Nissui Pharm) и лактозна хидрогенсулфатна среда (DHL, Enterobacteriaceae селективна среда, Eiken Chem, Токио, Япония). 41 агарни плаки DHL се отглеждат аеробно за 1 ден при 37 ° C, а BL агаровите плочи се отглеждат анаеробно в продължение на 3 дни при 37 ° C.

LJ и EC бяха избрани от колонии, отглеждани по същество в BL и DHL, съответно, и идентифицирани чрез оцветяване по Gram, тест за използване на захар (API 50 CHL или API 20 E Kit, bioMerieux, Сеул, Корея) и секвениране на 16S рРНК (ABI DNA Анализ 3730XL). Те бяха депозирани в кратко прочетения файл на Националния център за биотехнологична информация (NCBI) с номера за достъп KY751910 и KY751911.

Клетъчна култура Caco-2. Клетките Caco-2 бяха закупени от Korea Cell Line Bank (Сеул, Корея) и отгледани при 37 ° C в атмосфера от 5% CO2 -95% въздух в DMEM (Sigma), съдържащ 10% фетален говежди серум и 1% антибиотик- противогъбично. . За да се измери ефектът на LJ върху експресията на затворени свързващи протеини in vitro, клетките се третират със 100 ng ml-1 от фекалната LPS фракция в присъствието или отсъствието на LJ в продължение на 24 часа и нивата на експресия на свързващите протеини се затварят в него Лизатът се измерва чрез имуноблотинг.

Животни RaonBio доставя мъжки ICR мишки (25–27 g, на възраст 5 седмици). (Gyeonggi-do, Корея). Всички мишки бяха настанени в телени клетки при 20–22 ° C и 50 ± 10% влажност, хранени със стандартна лабораторна храна и вода ad libitum. Мишките бяха използвани в експериментите след аклиматизация за повече от 1 седмица. Всяка група във всички експерименти се състои от 10 мишки.

Всички експерименти с животни са одобрени от Комитета за грижа и използване на лабораторни животни към университета Kyung Hee и са извършени в съответствие с Насоките на университета Kyung Hee за грижа и използване на лабораторни животни (IRB номер KHUASP (SE) -15-092).

Приготвяне на експериментални колитични мишки. За приготвянето на мишки с индуциран от TNBS колит, 2,5% (w/v) разтвор на TNBS (100 μl, разтворен в 50% етанол) се инжектира интраректално в дебелото черво на мишки, анестезирани с етер 43 (допълнителна фигура S6a). За да се разпредели TNBS изцяло в дебелото черво, мишките се държат във вертикално положение за 30 s след третиране с TNBS. Нормалната контролна група се лекува с физиологичен разтвор вместо TNBS. Мишките бяха убити 24 часа, 8-мия ден и 15-ия ден след третиране с TNBS.

За приготвянето на EC-индуциран колит, на мишките се прилага перорално ЕС суспензия (1 × 10 9 CFU, суспендирана в 100 μl 1% глюкоза) веднъж дневно в продължение на 5 дни (допълнителна фигура S6b). Нормалната контролна група се лекува с 1% глюкоза вместо EC. Мишките бяха убити 24 часа, 8-мия ден и 15-ия ден след лечението с ЕК.

За приготвянето на LPS-индуцирано увреждане на паметта, на мишките се прилага интраперитонеално LPS разтвор (8 μg kg -1, разтворен във физиологичен разтвор) веднъж дневно в продължение на 10 дни (допълнителна фигура S6c). LPS е изолиран от EC. Нормалната контролна група се лекува с 1% глюкоза вместо EC. Мишките бяха убити 48 часа след последното приложение на LPS лечение.

Задача за пасивно избягване. Задачата за пасивно избягване беше изпълнена в акрилна кутия с две отделения, свързана към осветено отделение (20 × 20 × 20 см) към тъмно отделение (20 × 20 × 20 см) чрез входен отвор (5 × 5 см) според метод на Jung et al. 44 Накратко, в опита за придобиване на мишка беше поставена в осветеното отделение на 1-ви, 8-ми и 15-ия ден след третиране с TNBS, EC или неговия LPS и, когато мишката влезе в тъмната камера, токов удар от 0,3 mA за 2 s е дадено чрез подови решетки. Проба за задържане беше извършена 24 часа след пробата за придобиване и беше измерено времето на латентност за повторно влизане в тъмната камера.

Задача Y-лабиринт. Y-лабиринтът се изпълнява в трираменен хоризонтален лабиринт (дълъг 40 cm и широк 3 cm с високи 12 cm стени), в който раменете са разположени симетрично под ъгъл 120 ° един от друг, съгласно метода на Jung et към. 44 Лабиринтният под и стените са направени от тъмна непрозрачна поливинилова пластмаса. Мишка първоначално беше поставена в рамките на едно рамо на 1-ви, 8-ми и 15-ия ден след лечение с TNBS, EC или неговия LPS, а последователността (т.е. ACABC и т.н.) и броят на влизанията в рамото бяха записани ръчно за всяка мишка за 8 мин. Действителната редуване беше дефинирана като влизане във всичките три рамена при последователни избори (т.е. ABC, CAB или BAC, но не ABA). Лабиринтните ръце бяха добре почистени между задачите, за да се премахнат остатъчните миризми. Редуването (%) беше посочено, както следва: редуване (%) = [(брой редувания)/(брой на общите влизания в рамото - 2)] × 100. Броят на влизанията в рамото служи като индикатор за двигателната активност.

Анализ на MPO активност. Дебелото черво на мишка се хомогенизира в 10 m М калиев фосфатен буфер (рН 7.0), съдържащ 0.5% хексадецил триметил амониев бромид и се центрофугира в продължение на 10 минути при 20 000 g при 4 ° С. 45 Супернатантата (50 μl) се добавя към реакционната смес (0,1 m MH202 и 1,6 m М тетраметилбензидин), инкубира се при 37 ° С в продължение на 2 минути и след това периодично се проследява абсорбцията при 650 nm в продължение на 5 минути. MPO активността беше изчислена като количеството ензим, разграждащо 1 μmol ml -1 пероксид, и изразено в единица на mg протеин.

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ и имуноблотинг. Дебелото черво на мишката или хипокампусът се хомогенизира в лизисния буфер RIPA, съдържащ 1% коктейл инхибитор на фосфатаза и 1% коктейл инхибитор на протеаза върху лед и се центрофугира при 15 000 g при 4 ° С в продължение на 15 минути. Култивираните Caco-2 клетки се хомогенизират в RIPA лизисен буфер, съдържащ 1% коктейл инхибитор на фосфатаза и 1% коктейл инхибитор на протеаза върху лед. Нивата на цитокините в супернатантите са измерени с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен комплект за анализ (Ebioscience, Atlanta, GA).

За имуноблотинг, супернатантите на дебелото черво и култивираните клетъчни хомогенати се подлагат на SDS-полиакриламидна гел електрофореза и се прехвърлят в нитроцелулозна мембрана. 45 протеини бяха сондирани с антитела, открити с конюгирани с пероксидаза хрян вторични антитела и визуализирани с ECL комплект за откриване.

Анализ на Limulus амебоцитен лизат. Съдържанието на ендотоксин в кръвта и фекалиите се определя с помощта на диазо-куплирани лимулни амоебоцитни лизатни анализи (Cape Cod, E. Falmouth, MA), съгласно метода на Kim et al. 41 Накратко, за определяне на концентрацията на ендотоксин в кръвта, плазмата се разрежда в безпирогенна вода 10 пъти, инактивира се при 70 ° С в продължение на 10 минути и след това се инкубира с limulus амебоцитен лизат в продължение на 30 минути при 37 ° C. Добавянето на реагенти доведе до образуване на пурпурно производно, което поглъща светлина при 545 nm.

За определяне на концентрацията на фекален ендотоксин, 20 mg изпражнения от дебелото черво се поставят в 50 ml PBS в безпирогенна епруветка и се обработват с ултразвук за 1 h върху лед. 41 След центрофугиране при 400 g в продължение на 15 минути, горните 30 ml се събират, стерилизират се чрез филтриране през 0,45 μm филтър, последвано от повторно филтриране през 0,22 μm филтър, и инактивиране за 10 минути при 70 ° C. Филтрираният ултразвук се използва за определяне на ендотоксин.

Статистически анализ. Данните са посочени като средна стойност ± sd Статистическият анализ на данните е извършен с анализ на дисперсията и тест на Дънкан. Разлики с P