Обобщение

MRNA на Brca1 се открива в тъканите на млечната жлеза на възрастни девствени женски мишки по време на бременност и ранна лактация. Той е свързан с фази на пролиферация и диференциация на епителните клетки на млечната жлеза, но моделът на експресия на Brca1 е неразделен от този на истинския маркер за диференциация, β-казеин, поради значителната му експресия в девствената жлеза и прекратяването на експресията в ранна детска възраст. . В първичен модел на клетъчна култура, асоциацията на богат на ламинин извънклетъчен матрикс (ECM) с клетки на млечните епители се изисква за клетъчно оцеляване и клетъчна диференциация и потиска експресията на Brca1 в тези клетки. Асоциацията на ECM може да допринесе значително за крайното ограничение в експресията на Brca1 в лактиращата жлеза in vivo . Интересното е, че нашите резултати показват, че епителните клетки на млечната жлеза претърпяват апоптоза, когато експресират и когато не експресират Brca1, в зависимост от това дали умиращите клетъчни популации са окончателно диференцирани.

Достъпът е предоставен от

Въведение

Brca1 изпълнява една или повече основни функции в ранната ембриогенеза и изглежда необходима за ембрионалната пролиферация и развитието на зародишни слоеве и невронни структури. 38, 40, 41, 42. Дефицитът в клетъчната пролиферация лежи в основата на неуспеха на Brca1 (и Brca2) нулеви ембриони да оцелеят и се предполага допълнително от тяхната свръхекспресия на циклин-зависимия киназен инхибитор p21/Waf1. 41, 43 Експресията на Brca1 в множество места на органогенезата в по-късната ембриогенеза и в различни възрастни тъкани, като тимус, тестис, епител на гърдата и фоликули на яйчниците, предполага значение за продукта (ите) на този ген в един или повече основни процеси на развитие, и това се изразява в местата за разпространение, където скоро ще последва диференциация. Освен това експерименталното инхибиране на експресията на BRCA1 води до ускорен растеж на нормални и злокачествени епителни клетки на млечната жлеза, но не и на не-млечни епителни клетки, свръхекспресията на 45 и BRCA1 причинява забавяне на растежа in vitro, по-специално на туморните клетъчни линии. Гърдата и яйчниците. 46

Съобщената експресия на Brca1 в постнаталния млечен епител по време на пубертета и бременността 37, 44 предполага, че генният продукт функционира в пролифериращи и/или диференцирани клетки. Към днешна дата се съобщава, че транскрипцията на гърдите на гена Brca1 е висока в средата и края на бременността, като изглежда намалява по време на кърмене и ранна инволюция, но отново става забележима 5 до 7 дни след отбиването. Експресията на 37,44 Brca1 се регулира в култивирани клетки от G1/S до M47, което отново означава роля в пролиферацията. Експресията на човешки хомолог, BRCA1 и BRCA2 изглежда ще бъде подобна на регулиран клетъчен цикъл с повишени нива на иРНК в късната G1/S по-ранна фаза, предшестваща синтеза на ДНК, в култивирани клетки. 15, 48, 49 Кинетиката на регулиране на експресията на Brca1 по време на епителната активност на млечната жлеза в пубертета и бременността е отразена в Brca2. 39, 47

Резултати

Анализът на цялата рамка 50 на млечната жлеза при възрастни мишки (Фигура 1А) разкрива растежа на дукталната и алвеоларната система от девственото състояние, от бременността до пълното развитие на лактацията: в средата на бременността се наблюдава обилно разклоняване на протока и силно начално алвеоларно развитие . . В ранна детска възраст е постигнато пълно алвеоларно развитие и се наблюдава максимална колонизация на цялата мастна подложка. Тези събития отразяват вълни от пролиферация на епителни клетки по време на бременност и още в ранна детска възраст. Отбиването причинява появата на инволюция, която включва последователно застой на мляко в алвеолите, фаза на интензивна апоптоза на алвеоларните епителни клетки и, накрая, фаза на намаляване на ремоделирането на жлезата, свързана със значителна активност на локалната матрична металопротеаза. 52, 53 Пълното 4-дневно неволно монтиране на жлеза показва значителна алвеоларна регресия и това продължава с течение на времето (Фигура 1А и резултатите не са показани).

свързването

Изображение в пълен размер

Фигура 1С демонстрира специфичността на измерването на Brca1 PCR; първият панел показва усвояването на продукта RT-PCR в предсказан уникален вътрешен сайт Ear1 (вижте карикатурата); вторият панел показва резултата от Southern blot на храносмилателните продукти Ear1 и целевата ДНК, използвайки вътрешна сонда, която открива целевата ДНК лента и продукта от 303 bp, както се прогнозира. Третият панел показва резултата от полу-вложен PCR с: първичният продукт на PCR (535 bp) като шаблон; олигонуклеотидът "Южна сонда" като преден праймер и като се използва първичният обратен праймер на PCR. Това генерира една лента от 366 bp, както се очаква (ленти 4 и 5). Следователно, ние преценяваме нашите Brca1 RT-PCR продукти от тъканни проби и първични клетъчни култури, за да отразяват валидно клетъчните Brca1 транскрипти.

Изображение в пълен размер

В обобщение, резултатите ни водят до три основни извода: (1) че експресията на Brca1 и в двете изследвани моделни системи, in vivo и in vitro (първична клетъчна култура), е свързана главно с клетъчната пролиферация; (2) Че експресията на Brca1 и в двете изследвани моделни системи е потисната в напълно диференцираната, "оцеляла" млечна епителна клетка; Клетъчното взаимодействие с богат на ламинин ECM беше показано за първи път като критично за тази репресия; и (3) че експресията на Brca1 в популации от млечни епителни клетки, ангажирани с апоптоза, може да се различава в зависимост от физиологичното състояние на клетките: когато апоптозната популация преди това е била свързана с ECM, не се наблюдава експресия на Brca1; когато апоптотичната популация не се свързва с матрицата, експресията на Brca1 се поддържа.

Дискусия

Материали и методи

Дисектираната млечна тъкан от наивни (на 5 седмици), бременни и кърмещи мишки CD1 се замразява бързо в течен азот и се съхранява при -70 ° C за последваща подготовка на РНК. Четвърта млечна (ингвинална) жлеза беше използвана за фиксиран с метакарн и зацапан с кармал пълен кадър, както е описано от Edwards et al. 50 първични млечни епителни клетъчни култури 59, 74, 75 бяха приготвени от млечните жлези на бременни CD-1 мишки от 14-19 дни, както беше описано наскоро. 57 След отглеждане в условия на „пролиферация“ в продължение на 48 h, популациите от „апоптотични клетки („ по-малко ECM “)“ се култивират в отсъствието на серум и EGF и в отсъствието на ECM (Matrigel), но в присъствието на лактогенни хормони и оцелели/диференцирани клетки („повече ECM“), култивирани в отсъствие на серум и EGF, но в присъствието на ECM (ECH, получен от тумор ECM, Matrigel (Becton Dickinson)) и лактогенни хормони. 57 Впоследствие те бяха събрани за FACS, FACS/TUNEL анализ на клетъчния цикъл и обща РНК изолация и RT-PCR анализ. Анализът на клетъчния цикъл на FACS се извършва, както е описано наскоро. 57

Съкращения

ген за чувствителност към рак на гърдата 1

извънклетъчният матрикс

Флуоресцентно активирано клетъчно сортиране/TdT-медиирано биотитилирано dUTP крайно маркиране