Връзка между цитотоксичната активност и био-енергийния метаболизъм на съединения от растителен произход. Проект за последна степен [Напишете тук] Пабло Фуентес Ороско Биологически факултет. Севиля, 2015 г.

цитотоксичната

На моите родители и сестра ми, че ме мотивираха и повярваха в мен от момента, в който започнах този проект, наречен кариера. На майка ми, благодаря ти за тази привързаност, която ми предаваш и че вложи цялата си страст в мен. На баща ми благодаря, че ме научихте какво е смелост и защото никой не знае как да слушате като вас. Бих искал да благодаря на моя учител Хавиер Авила, благодаря, че ме насочихте с търпение и дух, също Елена Талеро, Азахара Родригес и Антонио Алкаиде, за всеки жест на насърчение и за това, че отделихте вашето време на мое разположение. И накрая, и не по-малко важно, благодарение на всеки от приятелите, които бяха с мен през тези години, на първия и последния пристигащ, на всеки луд човек, който ми прави деня и на всички, които ме изслушаха и подкрепиха, когато не съм. нямаше никой. Благодарим ви, че създадохте група от приятели семейство. Благодаря Kalise. Ако наистина ви е грижа за нещо, борете се за това. Ако ударите стена, преминете през нея! Има нещо, което трябва да знаете за провала. Никога не трябва да го оставяте да ви бие. (Капитан Хедок)

ИНДЕКС Съкращения Резюме i ii I. ВЪВЕДЕНИЕ 1 1. Оксилипини в растителното царство 1 1.1. Ясмонати. Биологични функции 2 1.2. Метил жасмонат като агент с противоракова активност 3 2. Оксилипини в животинското царство 5 3. Текущо състояние на рака 6 II. ЦЕЛИ 8 III. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ 9 1. Използван материал 9 1.1. Метил жасмонат 9 1.2. Клетъчни култури 10 2. Проучвания in vitro 11 2.1. Оценка на цитотоксичната активност на метил жасмонат 11 2.1.1. Метод на сулфородамин В 11

2.2. Изследвания на биоенергийния метаболизъм 12 2.2.1. Количествено определяне на ATP 14 2.3. Оценка на противовъзпалителната активност на метил жасмонат 14 2.3.1. Производство на туморен фактор некроза-алфа 14 3. Статистически анализ 15 IV. РЕЗУЛТАТИ 16 1. Цитотоксична активност на метил жасмонат 16 2. Цитотоксични механизми. Ефекти върху биоенергийния метаболизъм 19 3. Противовъзпалителна активност на метил жасмонат 21 V. ДИСКУСИЯ 23 VI. ЗАКЛЮЧЕНИЯ 27 VII. БИБЛИОГРАФИЯ 28

Съкращения АА арахидонова киселина ADP аденозин бифосфат AJ жасмонова киселина ANOVA анализ на вариацията АТР аденозин трифосфат CJ цис-жасмонат СОХ циклооксигеназа DEX дексаметазон DHA докозахексаенова киселина анализ DMSO диметилсулфоксид ELISA от имуно-абсорбция рак ICENEAN международни изследвания Она canceric киселина ензим IAR за EPA ензими ICENAT изследвания агенция 50 инхибиторна концентрация 50 IL интерлевкин J2 метил 4,5-дидехидроясмонат J7 метил 5-хлоро-4,5-дидехидроясмонат LLC хронична лимфоцитна левкемия LOX липоксигеназа LPS липополизахарид MJ метил жасмонат WHO световна здравна организация OPDA 12-oxo-phyxodi PSOX фосфатно буфериран физиологичен разтвор PMA форбол ацетат миристат ROS реактивен с кислород вид SRB сулфородамин B TCA трихлороцетна киселина THP-1 човешка остра левкемия моноцитна линия TNF-α тумор фактор на некроза алфа TRAIL TNF-α 2-DG свързана апоптоза индуцираща лиганд 2-дезокси-D-глюкоза i

Фигура 1. Биологични функции на язмонатите и тяхната сигнализация, медиирана от биотични и абиотични процеси. 1.2. Метил жасмонат като агент с противоракова активност. MJ е естествен циклопентанон (Фигура 2), който принадлежи към семейството на оксилипините като хормони за реакция на стреса на растенията (Liechti and Farmer, 2002). Производството му се индуцира от различни видове околна среда (UV лъчение, осмотичен стрес и температурни вариации) и биотични сигнали (патогени, тревопасни животни) (Ryals et al., 1996; Beckers and Spoel, 2006; Van der Ent et al., 2009) и медиира сигнализирането, което активира защитните реакции срещу тези видове стрес (Vasyukova et al., 2009). В допълнение към това, че действа като растителен вторичен метаболит, индуцирайки защитата на растенията, MJ има забележим ефект върху раковите клетки на бозайници (Avdiushko et al., 1995; Kato et al., 1993; Melan et al., 1993; Fingrut and Flescher, 2002 ). Ясмонатите променят митохондриалната функция на растението и индуцират образуването на реактивни кислородни видове (ROS), което води до клетъчна смърт по път, подобен на апоптоза при бозайници (Soares et al., 2010; Zhang and Xing, 2008). Установено е, че MJ има 3

II. ЦЕЛИ Растителните язмонати са показали задоволителна биологична активност в областта на рака благодарение на техните цитотоксични механизми, свързани с индукцията на клетъчна смърт в различни линии на човешкия рак. Доказано е, че метиловият язмонат (MJ) е полезен в синергична комбинация с лекарства, използвани в момента за колоректален рак и някои клетъчни линии на левкемия. Следователно основната цел на този експериментален проект за финална степен е да се оцени потенциалната биологична активност (противоракова и противовъзпалителна) на MJ, оксилипин от растителен произход. Следователно тази работа се фокусира върху няколко конкретни цели: 1. Да се ​​изследва цитотоксичната активност на чистото съединение MJ, върху моноцитна линия на човешка остра левкемия (THP-1), както в моноцитно, така и в макрофажно състояние. 2. Оценете дали цитотоксичният механизъм пречи на биоенергийния метаболизъм на THP-1 клетки в състояния на моноцити и макрофаги. 3. Да се ​​изследва противовъзпалителната активност чрез изследване на ефективността на MJ върху производството на цитокин TNF-α в клетки THP-1, трансформирани в макрофаги. 8

III. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ 1. ИЗПОЛЗВАН МАТЕРИАЛ 1.1. Метил жасмонат За извършване на тази работа е използван метил жасмонат (Sigma-Aldrich Química, S.L. Испания), който се съхранява в тъмни условия и се съхранява при 4 ° C. За употреба, този продукт е приготвен в диметилсулфоксид (DMSO) при концентрация от изходните вещества 4400 mm. Различните концентрации за изследването са проведени чрез съответните разреждания с пълна хранителна среда и последваща обработка с ултразвук в баня при стайна температура за правилното му хомогенизиране. Във всеки случай процентът на DMSO в клетъчните култури е по-малък от 1%, за да се гарантира жизнеспособността на клетките. работа. Таблица 1. Номенклатура и структура на чистото съединение MJ, с което е извършено това 9

1.2. Клетъчни култури Клетъчната линия, използвана за извършване на тази работа, е човешка остра левкемия моноцитна клетъчна линия, THP-1, това е любезно предоставено от професор Франсиско Муриана от Института за ла Граса в Севиля (Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Севиля) към групата по молекулярна и приложна фармакология (FARMOLAP), в която е извършена голяма част от тази работа. Клетките се култивират при 37 ° C, в атмосфера с 5% CO2 и висока влажност, в среда RPMI 1640 с 2mM L-глутамин и 25mM HEPES (GIBCO, САЩ), допълнена с 10% фетален телешки серум (PAA) и 100U/л пеницилин/стрептомицин (PAA). Тази клетъчна линия се поддържа в моноцитно състояние (растеж в суспензия) или нейното диференциране до макрофаги (адхерентно състояние) се индуцира с РМА (0,2 цт) в продължение на 72 часа. Фигура 3. Линия за остра левкемия на THP-1, наблюдавана под микроскоп с обърната светлина. THP-1 клетки в моноцитно състояние с цел 10Х (А); THP-1 клетки в състояние на макрофаги с цел 40X (B). 10

Техниката SRB се използва предимно за избор на нецитотоксични дози MJ за последващи изследвания на клетъчната сигнализация и експресия на цитокини. Фигура 4. Протокол, следван при сулфородаминов метод Б. 2.2. Изследване на биоенергийния метаболизъм За изследване на енергийния метаболизъм на клетки, третирани с MJ, беше проведена оценка на концентрациите на АТФ при различните използвани дози MJ. Тази оценка се извършва на THP-1 клетъчна линия, както в състояние на макрофаги, така и в състояние на моноцити. В състояние на макрофаги се извършва чрез засяване на 10 000 клетки в краен обем от 100 µl на гнездо. За това бяха използвани стерилни 96-12 NUNC плаки.