- Субекти
- Обобщение
- Въведение
- Резултати и дискусия
- Чревната микробиота и H. pylori повлияли нивата на лептин и грелин
- Индуцирано нормално производство на инсулин за чревна микробиота и H. pylori
- PYY индуциран от H. pylori но потиснати от нормална чревна микробиота
- Чревни метаболитни хормони и телесна маса
- Възможни въздействия на чревната микробиота и H. pylori в ранното развитие
- Методи
- Щам на H. pylori и подготовка на инокулум
- Животни и инокулация
- Етични изявления
- Събиране на плазмени проби
- Мултиплекс анализ за чревни хормони и цитокини
- статистически анализ
- Коментари
Субекти
- Клинична микробиология
- Експериментални модели на болестта.
Обобщение
Въведение
Древният стомашен патоген, Helicobacter pylori, е ключов член на човешкия стомашен микробиом. Той се разви съвместно с човешката раса и нашата връзка с H. pylori датира от 60 000 години 9. Освен това, той живее в стомаха на повече от половината от световното население, независимо от техния етнически произход и географски регион 10. Много от тях са придобили бактериите през ранното детство чрез вътрешносемейно предаване и колонизация е през целия живот, освен ако не бъдат унищожени чрез медицинска намеса 9. Въпреки че повечето носители остават безсимптомни, приблизително 20% от тях в крайна сметка развиват гастродуоденални заболявания (като хроничен гастрит, пептична язва и стомашен аденокарцином) в последните етапи от живота. Много фактори, включително H. pylori, чревната микробиота, гостоприемника и околната среда, могат да допринесат за развитието на заболявания, свързани с H. pylori. .
В това проучване нашата цел беше да изследваме взаимодействието между H. pylori и нормалната чревна микробиота през ранните етапи от живота, използвайки модели на мишки GF и SPF. За да разберем влиянието на H. pylori и нормалната чревна микробиота върху развитието на метаболитната и имунната система, оценихме промените в метаболитните хормони в червата и цитокините/хемокините в отговор на колонизацията на H. pylori при мишки. GFH и SPFH.
Резултати и дискусия
Възстановихме H. pylori от мишки, инокулирани с SPFH и GFH, на 2, 8 и 16 седмици след колонизацията. Това демонстрира, че щам 298 на H. pylori успешно колонизира стомаха на мишки, инокулирани с този организъм. От друга страна, нито една от SPF и GF мишките не е била положителна за H. pylori .
Въздействието на H. pylori върху състава и функцията на нормалния чревен микробиом не е напълно изяснено. В това проучване обаче нашите предварителни резултати демонстрират, че H. pylori може да промени енергийната хомеостаза на своя гостоприемник и че нормалният чревен микробиом може да направи разлика в ефекта на H. pylori върху неговия гостоприемник.
Чревни метаболитни хормони и телесна маса
Мета-анализ, отчитащ честотата на разпространение на H. pylori и затлъстяването в случайни популационни проби от над 100 човешки субекта, установява, че е налице обратна корелация между разпространението на бактериите и степента на наднормено тегло/затлъстяване в развитите страни По-рано беше показано, че свързаните с храната нива на циркулиране на лептин и грелин се променят след ерадикация на H. pylori при човешки доброволци със свързано увеличение на индекса на телесна маса (ИТМ), предоставяйки доказателства, че Н колонизацията pylori може да регулира нивата на грелин и лептин, които засяга морфометрията на тялото 30. В това проучване е показано, че колонизацията на H. pylori при млади GF мишки води до намалено увеличаване на телесната маса.
SPFH мишките имат значително по-висок лептин, инсулин и PYY на гладно от SPF мишките. Въпреки разликите в нивата на хормоните, SPFH мишките имаха нормална телесна маса. Ние постулираме, че свързаното с H. pylori регулиране на PYY стимулира гостоприемника да произвежда повече инсулин и лептин в отговор, като по този начин поддържа нормална телесна маса. Въпреки това, дългосрочните последици от повишеното PYY гладуване, инсулин и лептин все още не са определени. От друга страна, GF и GFH мишките са имали по-големи количества грелин, по-нисък лептин и по-нисък инсулин от SPF и SPFH мишки. Освен това, 16-седмичните GFH мишки са имали по-високо ниво на PYY от GF мишките. Всички тези хормонални разлики между мишките GF и GFH в сравнение с мишките SPF и SPFH могат да бъдат свързани с телесните им маси. Интересното е, че ефектът на H. pylori върху телесната маса е по-очевиден при мишки с GFH при липса на нормална чревна микробиота.
Определена е връзката между телесната маса и различните чревни метаболитни хормони/еотаксин-1 (Таблица 1). Показано е, че нивата на лептин и PYY са значително свързани (стр. 30. Следователно, метаболитните хормони, които регулират H. pylori, могат да играят роля при задържането на затлъстяването.
Възможни въздействия на чревната микробиота и H. pylori върху ранното развитие
Heijtz et al. съобщава, че същите GF мишки, използвани в това проучване, демонстрират по-голяма двигателна активност и по-малко тревожност в сравнение с SPF 8 мишки. Това корелира с променената експресия на гени, които регулират двигателния контрол и поведението, подобно на тревожността. Същият доклад също така показва, че GF мишки, изложени на нормална чревна микробиота в началото на живота си, имат подобни характеристики на SPF мишки. Това наблюдение може да бъде свързано с променена хранителна абсорбция при GF мишки при липса на нормална чревна микробиота, което води до недохранване и загуба на тегло. Добре известно е, че хранителното ниво оказва пряко влияние върху ранните етапи на развитие (включително развитието на мозъка и наставника). Освен това е показано, че нокаут мишките с грелин увеличават тревожността в отговор на различни стресови фактори, като остър стрес и социален стрес, в експериментални условия 31. По-високото ниво на грелин при GF мишки също може да обясни промененото поведение при GF мишки, съобщено от Heijtz et al. .
Повишеното ниво на еотаксин-1 в кръвната плазма също е свързано със стареенето при мишки и хора 32. Излагането на млади мишки на еотаксин-1 или кръвната плазма на по-възрастни мишки намалява тяхната неврогенеза и когнитивната ефективност при поведенчески задачи, които зависят от неврогенезата в хипокампуса 32. Интересното е, че голямо популационно кохортно проучване в Дания установи корелация между хроничната H. pylori и/или гастрит и болестта на Паркинсон 33. Установено е, че нивото на хемокин, еотаксин-1, е по-високо при SPFH мишки (стр. 34. Следователно, високото ниво на еотаксин-1 при SPFH мишки ни доведе до хипотезата, че тези хемокини са служили като индикация. Ранното възпаление и взаимодействието между H. pylori и нормалната чревна микробиота могат да засилят хроничното възпаление. Следователно излагането на H. pylori през ранните етапи на развитие може да има дългосрочни последици за развитието на мозъка. За съжаление, не сме провеждали никакви поведенчески изследвания или моторни контролни тестове в това проучване, за да потвърдят това.
В заключение, това проучване при SPF и GF мишки със и без H. pylori предполага, че стомашният патоген, H. pylori, взаимодейства с нормалната чревна микробиота, променяйки метаболитните и възпалителни пътища при SPFH мишки в сравнение с SPF мишки (Фигура 3) . Нашите резултати също така предполагат, че има непрекъсната кръстосана връзка между H. pylori и нормалната чревна микробиота, която е свързана с чревно възпаление. Предишни данни са установили причинно-следствена връзка между H. pylori и стомашна язва и рак на стомаха. Данните, представени в това проучване, свързващи H. pylori с кръстосани връзки с нормалната чревна микробиота, показват, че появата на медиирани от H. pylori заболявания при хората е по-сложна. Следователно допълнителните експерименти са силно гарантирани, особено през първите години от живота.
Нормалната чревна микробиота играе важна роля в регулирането на хомеостазата на метаболитния хормон на червата, която влияе върху развитието на нормална мозъчна и телесна маса. В допълнение, нормалната чревна микробиота също влияе върху резултата от колонизацията на H. pylori, като влияе върху чревните метаболитни хормонални промени и индуцираното от H. pylori възпаление. .
Изображение в пълен размер
Методи
Подготовка на щам на H. pylori и инокулум
В това проучване е използван щамът на H. pylori, адаптиран към мишки C57BL/6, 298. Геномът на този щам е напълно секвениран 35. Накратко, H. pylori се култивира в инфузионен бульон от мозъчно сърце, допълнен с 0,4% екстракт от дрожди и 1% ß-циклодекстран (BHYC) в продължение на 4 дни при 37 ° C в овлажнен инкубатор с CO2 при 10%. Броят на бактериите се регулира до концентрацията от 10 9 бактерии на ml, който да се използва за инокулиране на животни.
Животни и инокулация
За експерименти са използвани мъжки SPF и GF C57BL/6 мишки на възраст от 4 до 6 седмици. Използвани са мъжки мишки, тъй като се съобщава, че показват по-висока честота на стомашен карцином от чревен тип в сравнение с женските 36. Всички мишки (SPF и GF) бяха държани в стерилни пластмасови изолатори в Центъра за свободни зародиши (NCC) на Националния център за борба с рака, разположен в Центъра за експериментална медицина SingHealth. Животните бяха държани в автоклава R36 Lactamin Chow (Lactamin, Швеция) и държани при условия на светлинен цикъл 12 h. Животните бяха разделени на четири групи по 12 (SPF, SPFH, GF и GFH). SPF и GF мишките за инокулация на H. pylori бяха на гладно цяла нощ и хранени с 0,1 ml бактериална култура интрагастрално три пъти с интервал от 1 ден в средата. Контролните животни бяха инокулирани със стерилна BHYC среда по същия начин. Впоследствие мишките бяха умъртвени 2 седмици (N = 3 на група), 8 седмици (N = 5) и 16 седмици (N = 5) след колонизация. Гастричните мишки се събират за култура на H. pylori и плазмата се използва за анализ на хормони и цитокини.
Етични изявления
Всички експериментални процедури бяха одобрени и проведени в съответствие с регламентите и насоките на институционалния комитет по грижи и употреба на животните SingHealth (IACUC; заявление № 2011/SHS/680) и Националния комитет по рака на Националния център за борба с рака Сингапур/SingHealth комитет по биобезопасност (IBS); Заявление № 010/RBC/2011).
Събиране на плазмени проби
Кръв се взима в охладени с EDTA епруветки и се смесва внимателно чрез инверсия. Кръвта се прехвърля в студена епендорфска епруветка, съдържаща 2М 4- (2-аминоетил) бензенсулфонил флуорид хидрохлорид (AEBSF, Sigma-Aldrich, Buchs, Швейцария) до крайна концентрация от 0,2 М и се разбърква внимателно. Епруветката се центрофугира при 3000 х g за 3 минути (4 ° С). Получената плазма се добавя към криотръба, съдържаща 1N HCI, за да се получи крайна концентрация от 0,1N и се съхранява при -80 ° С до анализ.
Културата на H. pylori от стомашния стомах на мишката се хомогенизира и инокулира върху плочи от шоколадов агар, допълнени със 7% лизирана конска кръв и, в случай на селективна среда, триметоприм (5 μg/ml), ванкомицин (10 μg/ml), налидиксинова киселина. (20 ug/ml) и амфотерицин В (5 ug/ml) бяха добавени. Всички антибиотици са от Sigma-Aldrich Corporation (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Агаровите плочи се инкубират едновременно при 37 ° С в овлажнени условия с 10% въглероден диоксид. Колонии, подобни на H. pylori, са потвърдени чрез положителност с тестове за уреаза, оксидаза и каталаза.
Мултиплекс анализ за чревни хормони и цитокини
Панелът Milliplex MAP Kit за мишки с метаболитни магнитни мъниста (Каталожен номер MMHMAG-44K; Millipore Corp., MO, USA) е използван за количествено определяне на осем чревни хормони, които са важни регулатори на приема на храна., Разход на енергия и телесна маса: ацилиран (активен ) грелин, лептин, активен амилин, инсулин, активен глюкагоноподобен пептид-1 (GLP-1), общ стомашен инхибиторен полипептид (GIP), общ пептид YY (PYY) и панкреатичен полипептид (PP). За измерване на панел от 32 различни миши цитокини/хемокини беше използван панел от миши цитокин/хемокин магнитни зърна (каталог # MPXMCYTO-70K; Millipore Corp., MO, USA). Използвана е плазма и тестовете са проведени в съответствие с инструкциите на производителя. Измерването беше извършено на системата Luminex 200 ™ със софтуер xPONENT ™, версия 3.1 (Luminex, Austin, TX, USA).
статистически анализ
Статистическите анализи бяха извършени със софтуера IBM SPSS версия 22.0. Еднопосочен ANOVA (алфа = 0,05) и честно значимата разлика на Tukey (HSD) post-hoc тест. Извършена е параметричната корелация на Пиърсън. Стойността на p