мастния

  • Субекти
  • Обобщение
  • Цел:
  • Резултати:
  • Завършеност:
  • Въведение
  • материали и методи
  • Приготвяне на кефир
  • Дизайн и проучване на животни.
  • Състав на тялото
  • Разхищение на енергия
  • Определяне на биохимични маркери.
  • Маслено червено петно ​​O
  • Оцветяване с хематоксилин и еозин
  • Имунохистохимично оцветяване
  • Обратна транскриптаза в реално време (RT) -PCR
  • Анализ на Western Blot
  • статистически анализ
  • Резултати
  • Ефект на кефира върху хранителния прием, телесното тегло, теглото на черния дроб, базалната скорост на метаболизма и енергийните разходи
  • Ефект на кефира върху състава на тялото
  • Ефект на кефира върху хепатомегалия и увреждане на черния дроб
  • Ефект на кефира върху TG и TC
  • Ефект на кефира върху серумните биохимични параметри, свързани с чернодробната функция
  • Ефекти от лечението с кефир върху експресията на гени, участващи в липидното окисление и липогенезата
  • Кефирът потиска липогенезата
  • Дискусия
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнителна фигура 1
  • Word документи
  • Допълнителна таблица 1
  • Допълнителна таблица 2
  • Допълнителна легенда за фигурата

Субекти

  • Метаболизъм
  • Безалкохолна мастна чернодробна болест
  • Затлъстяване

Обобщение

Цел:

Затлъстяването на черния дроб често се свързва със затлъстяване, инсулинова резистентност и диабет. Тежкият мастен черен дроб понякога се придружава от стеатохепатит и може да доведе до развитие на хепатоцелуларен карцином. Понастоящем няма ефективно лечение за неалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD); следователно последните изследвания се фокусират върху разработването на ефективни терапии за лечение на това състояние. Това проучване има за цел да оцени ефектите на кефира върху метаболизма на липидите в черния дроб при ob/ob мишки, които обикновено се използват за моделиране на чернодробни заболявания на черния дроб.

Резултати:

Кефирът, който произхожда от Кавказките планини, е слабо алкохолно, кисело ферментирало мляко. 5 Тази напитка традиционно се произвежда чрез инокулиране на млякото със зърно кефир. Кефирът се използва клинично за лечение на стомашно-чревни заболявания, хипертония, исхемична болест на сърцето и алергии. 5, 6 Няколко проучвания демонстрират множество биологични активности на кефира, включително антибактериални, противогъбични, антиоксидантни, антидиабетни, антитуморни и имуностимулиращи ефекти. Вуйчич и др. 7 показа, че консумацията на кефир намалява нивата на серумен холестерол при хората.

В това проучване изследвахме дали лечението с кефир подобрява симптомите на синдрома на мастния черен дроб при мишки с неактивни лептинови (ob/ob) гени. Експресията на няколко гена, които кодират протеини, участващи в пътя на липогенезата, включително стерол регулаторен елемент, свързващ протеин 1 (SREBP1), синтаза на мастни киселини (FAS) и ацетил-КоА карбоксилаза (ACC) и в липидния окислителен път, включително пероксизомен пролифератор-активиран рецептор α (PPARα) и чернодробен карнитин палмитоилтрансфераза-1α (CPT1α) са измерени след лечение с кефир. Целта на това проучване беше да се разбере ефикасността и механизма на ефектите на кефира върху синдрома на мастния черен дроб, за да се насърчи използването му при модулирането или лечението на NAFLD.

материали и методи

Приготвяне на кефир

Кефирните зърнени култури се инокулират (5%, w/v) и се размножават в стерилизирано мляко при 20 ° C в продължение на 20 h, за да се активират. Зърната се извличат през сито, възстановяват се (10%, тегло/обем) в стерилизирано прясно мляко и се инкубират при 20 ° С в продължение на 20 часа. 8 След филтриране на зърната, ферментиралите продукти се лиофилизират като кефирен прах с помощта на лиофилизатор (VirTis, Warminster, PA, USA).

Дизайн и проучване на животни.

Състав на тялото

Съставът на тялото на цялото животно беше оценен с помощта на анализатора на състава на цялото тяло на мишка minispec (LF50), базиран на TD-NMR (Bruker Optik, Ettlingen, Германия). Този метод осигурява точно измерване на мазнини, мазнини, свободна течност и вода в живи мишки.

Разхищение на енергия

Системата TSE LabMaster-3930 (Бад Хомбург, Германия), използвана за индиректна калориметрия, извършва количествени компютърни измервания на базалния метаболизъм и енергийните разходи. За да се изчисли консумацията на кислород (VO 2), производството на въглероден диоксид (VCO 2) и дихателният коефициент (съотношението на VCO 2 към VO 2), бяха наблюдавани концентрациите на газ на входа и изхода на затворените камери. Базалният (лек цикъл за гладуващи животни) и общите метаболитни скорости (48 непрекъснати часа за свободно хранени животни) са изчислени от консумацията на O2 и производството на CO 2. Епизодите на хранене се наблюдават с прецизни везни и непрекъснато се записват, за да се изчисли приема на храна.

Определяне на биохимични маркери.

Нивата на GOT, GPT, TC и TC в серума и черния дроб се измерват колориметрично с помощта на автоматизиран анализатор (анализатор Beckman-Coulter Synchron LX20; Beckman, Fullerton, CA, USA). 13

Маслено червено петно ​​O

Замразените чернодробни срезове (5–7 µm) се оцветяват с Oil Red O за 20–30 min, промиват се и се оцветяват с хематоксилин за 5 min, за да се определи чернодробното натрупване на липиди. Представителните фотомикрографии са заснети при увеличение 400 × с помощта на камера, монтирана на микроскоп.

Оцветяване с хематоксилин и еозин

Чернодробната тъкан се фиксира в 10% буфериран формалдехид и се изследва с оцветяване с хематоксилин и еозин, както е описано по-горе. 14, 15, 16

Имунохистохимично оцветяване

Фиксираните с формалдехид и вградени в парафин участъци се нарязват на дебелина 5 µm, разделят се и се хидратират през градиент от алкохоли във вода и след това се обработват с вряща вода в продължение на 15 минути. Секциите се инкубират в 3% водороден пероксид в продължение на 10 минути, за да се блокира ендогенната пероксидазна активност и след това се инкубират една нощ при 4 ° С с първични заешки моноклонални антитела срещу SREBP-1 и АСС. За извличане на антиген, срезовете бяха имунооцветени с помощта на VECTASTAIN ABC комплект (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA), следвайки спецификациите на производителя. Диаминобензидин се използва за развитие на оцветяване, а срезите са оцветени с хематоксилин. 17, 18 Отрицателната контрола се състои в заместване на нормалния серум с първично антитяло.

Обратна транскриптаза в реално време (RT) -PCR

Общата РНК беше извлечена от чернодробна тъкан, използвайки реактив Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), както е посочено от производителя. Два микрограма (2 ug) от общата РНК се суспендират в 9 ul вода, обработена с диетилпирокарбонат; първата верига от комплементарна ДНК се синтезира, използвайки произволни праймери и ImProm-II RT (Promega, Madison, WI, USA) в общ обем от 20 µl. Реакцията се провежда при 42 ° С за 1 час. За по-нататъшно PCR амплифициране, аликвотна част (1:10) от RT продукта се регулира така, че да съдържа 0,1 ug от всеки праймер и се добавя допълнителен буфер към общ обем от 20 ul. RT-PCR в реално време се извършва с помощта на SYBR Green (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) върху анализатор Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Germantown, MD, USA). 19 За да се оцени генната експресия, RT-PCR в реално време се извършва с пет гена (PPARα, CPT1α, SREBP1, ACC и FAS), като се използва допълнителна ДНК от чернодробна тъкан. Като вътрешен контрол се използва комплементарна ДНК на β-актин.

Анализ на Western Blot

Експресията на белтъка на чернодробната тъкан се измерва чрез Western blot. Чернодробните тъкани се хомогенизират в 500 μl RIPA буфер (5 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1% NP40, 0,25% натриев дезоксихолат, 5 mM EDTA и етилен гликол-бис 1 m M (2-аминоетил-етер ) - N, N, N, N-тетраоцетна киселина). Хомогенатите се центрофугират при 12 000 g в продължение на 30 минути при 4 ° С. След това протеинът (40 ug) се разделя на електрофореза в полиакриламиден гел с 10% натриев додецил сулфат и се нанася върху блокове върху поливинилиден дифлуоридни мембрани. Мембраните се инкубират в блокиращ разтвор (5% говежди серумен албумин) при стайна температура в продължение на 2 часа и след това се инкубират с първично антитяло (SREBP-1, ACC или β-актин) в продължение на една нощ при 4 ° С. След измиване мембраните са инкубирани с конюгирано вторично антитяло с козе имуноглобулин G пероксидаза G. Мембраните са разработени с помощта на подобрена хемилуминесцентна Western blot система за откриване, както е описано по-горе. двайсет

статистически анализ

Експерименталните стойности се изразяват като средната стойност ± se. Всички данни бяха анализирани с помощта на t тест. Статистически значимите резултати са представени като P # или †) или P ## или ††).

Резултати

Ефект на кефира върху хранителния прием, телесното тегло, теглото на черния дроб, базалната скорост на метаболизма и енергийните разходи

Мишки с дефицит на лептин (ob/ob), лекувани със 140 mg kg –1 BW кефир, наддават по-малко тегло в дните 20–27 и тежат значително по-малко от мишките в ob/ob + Mock група (P –1 BW от кефир показва % увеличение на скоростта на метаболизма в сравнение с групата ob/ob + Sham (P –1 BW кефир значително увеличава общите дневни енергийни разходи в сравнение с ob/ob + Mock групата (P –1 Kefir BW повишена базална скорост на метаболизма и общата дневна разход на енергия и по този начин намалява печалбата от BW.

Ефекти от BW кефир ( да се ), дневен прием ( б ), базална скорост на метаболизма ( ° С ) и общите дневни енергийни разходи ( д ) от ob/ob и WT мишки. Данните са изразени като средно ± se * P –1 BW кефир показва значително по-ниско съдържание на мазнини и по-ниско и общо съдържание на вода в сравнение с мишките в нетретираната група ob/ob + Mock (P –1 BW на кефир намалена хепатомегалия и мазни и мазни образуване на черен дроб (Фигури 2b, f и j) при тези животни. Оцветяването с хематоксилин и еозин и маслено червено O оцветяване на черния дроб разкрива натрупване на липидни капчици в черния дроб на ob мишки./ob, третирани с групата Mock (Фигури 3a, e и i), докато липидните капчици (макровезикуларна мазнина) са редки в черния дроб на третирани с кефир ob/ob мишки (Фигури 3b, f и j). Мишките, които са получили WT (Фигури 3d, h и l) или не (Фигури 3в, g и k), получени кефир, не натрупва липидни капчици в черния дроб, както е анализирано от хистопатологията. Тези резултати показват, че лечението на ob/ob мишки в продължение на 4 седмици със 140 mg kg –1 BW кефир намалява макровезикуларно натрупване на мазнини в черния дроб и образуване на мастни тъкани.

Ефекти на кефира върху външната страна на черния дроб, левия лоб на черния дроб и мастната тъкан на ob/ob мишки и WT мишки. ( да се ), ( и ) Y ( i ): ob/ob + фалшива група като модел на мастна чернодробна мишка; ( б ), ( F ) Y ( j ): ob/ob + кефирна група като групата на мастните чернодробни мишки, лекувани; ( ° С ), ( ж ) Y ( к ): WT + Mock group като нормален контрол на мишката; ( д ), ( з ) Y ( л ): WT + кефирна група като група на лекувани нормални мишки. ( да се - д ) Покажете външните изгледи на черен дроб на мишката от четири различни групи. ( и - з ) Покажете левите чернодробни дялове на мишките в четирите различни групи. ( i - л ) Показва външните изгледи на мастната тъкан на мишките в четирите различни групи. Мащабна лента = 1 cm.

Изображение в пълен размер

Ефекти на кефира върху оцветяването с хематоксилин и еозин (H&E) и оцветяването с маслено червено O на хистологично секциониран черен дроб и мастна тъкан при ob/ob мишки и WT мишки ( да се ), ( и ), ( i ) Y ( м ): ob/ob + симулирана група; ( б ), ( F ), ( j ) Y ( н ): ob/ob + кефирна група; ( ° С ), ( ж ), ( к ) Y ( или ): WT + Mock група; ( д ), ( з ), ( л ) Y ( стр ): WT + група кефир. ( да се - д ) Изображенията бяха увеличени до × 200 или до ( и - л ) 400X. ( да се - з ) H&E оцветяване и ( i - л ) Маслено червено O оцветяване на хистологични чернодробни секции. ( м - стр ) H&E оцветяване на мастни хистологични срезове. Мащабна лента = 20 μm.

Изображение в пълен размер

Ефект на кефира върху TG и TC

( ДА СЕ ) Ефекти на кефира върху нивата на експресия на иРНК на ( да се ) гени за окисление на липиди (PPARα и CPT1α) и ( б ) гени за липогенеза (SREBP1, ACC и FAS) в чернодробните тъкани на ob/ob мишки и WT мишки, оценени чрез RT-PCR в реално време. Количествените RT-PCR данни се изразяват като средната стойност ± se (n = 6). * P ## P ## P –1 BW от кефир показва значително намалени нива на протеини SREBP-1 (140%; P –1 BW от кефир за 4 седмици значително намалява нарастването на BW и увеличава основния метаболизъм и общия дневен разход на енергия ( Фигура 1), но нито един от тези параметри не е променен при WT мишки. Атенюираната BW на третираните животни може да се дължи на наличието на намалено количество мастна тъкан и намален размер на адипоцитите (Таблица 1, Фигури 2 и 3). Следователно, Ho et al. 21 показват, че кефирът медиира антиадипогенни ефекти чрез инхибиране на диференциацията на адипоцитите в 3T3-L1 клетки.Следователно в това проучване очевидно са засегнати BW ob/ob мишки с повече адипоцити от WT мишки с по-малко адипоцити.

Таблица в пълен размер

Предложен механизъм на кефирно-медиирана модулация на липидния метаболитен път при ob/ob мишки с чернодробен синдром на NAFLD. Ефектите на кефира върху мастния черен дроб на ob/ob мишките могат да възникнат чрез инхибиране на метаболитните ензими на липогенния път, но не и на липидния окислителен път. Диаграмата показва, че кефирът може да инхибира експресията на SREBP-1, ACC и FAS протеини по време на синтеза на холестерол.

Изображение в пълен размер

В заключение, това проучване показва, че консумацията на 140 mg kg –1 BW кефир за 4 седмици отслабва нарастването на BW и серумното съдържание на GOT и GPT на ob/ob мишки. Освен това кефирът значително намалява експресията на иРНК и протеини на SREBP-1, ACC и FAS на иРНК и протеини, както и намален синтез на мастни киселини, съдържание на TG и натрупване на TC в чернодробните тъкани на лекувани ob/ob мишки. Следователно, това проучване демонстрира, че защитният ефект на кефира при ob/ob модели на мастен черен дроб се появява чрез инхибиране на пътя на чернодробната липогенеза, а не чрез насърчаване на използването на липиди.