Микробиологични условия за отглеждане на Helicobacter pylori

Мартин Алонсо Байона Рохас, Bact., Esp., Msc. (1)

(1) Професор в Медицинския факултет, Група за биомедицински изследвания и приложна генетика (GIBGA). Университет за приложни и екологични науки U.D.C.A. Богота Колумбия. e-mail: [email protected]

Дата на получаване: 09-17-12 Дата на приемане: 16-16-13

Навременна диагностика и култура на Helicobacter pylori От голямо значение е да се изследват характеристиките на неговия растеж, както и да се допринесе за познаването на класическата и молекулярна епидемиология, генетичното разнообразие и податливостта към антибиотици. Повсеместността и значението на този микроорганизъм като патоген в световен мащаб ни принуждава да обмислим и предложим ефективни алтернативи за неговото изолиране и рутинно идентифициране в микробиологичните лаборатории. Този преглед беше насочен към описание на литературата относно условията, необходими за култивирането на този микроорганизъм в лабораторията.

Ключови думи

Helicobacter pylori, микробиология, изолация, микробна култура.

ЗАДЕН ПЛАН

Изчислено е, че H. pylori заразява между 50 и 75% от населението на света. От всеки 10 души, заразени от този микроорганизъм, само един страда от заболяване и девет никога не го развиват. Инфекцията е етиологично свързана с появата на пептични язви, било то стомашни или дванадесетопръстника, и с развитието на специален тип стомашен лимфом, наречен малтом; по същия начин той участва в етиологичната мултикаузална верига за развитие на рак на стомаха (1). Всъщност Световната здравна организация класифицира този патоген като биологичен канцерогенен агент за човека (категория 1), където най-високата честота на инфекции се наблюдава през детството в развиващите се страни и изглежда е свързана с икономическите условия. И неблагоприятните хигиенно-санитарни условия (2, 3). Изглежда, че различните щамове са свързани с разнообразието в тяхната вирулентност и взаимодействието на фактори, включително етнически произход, лоша диета, пренаселеност, география и възраст (4).

Тази статия представя преглед на микробиологичните аспекти, ориентирани към културите, и факторите, заложени в нея. За библиографското търсене бяха проучени следните бази данни: Medline, Proquest, Embase, Jstore, Pubmed, Hinary, Springer, Nature, Science онлайн и Oxford Journal и в частни списания като Plos, Nas и Imbiomed. Термините бяха комбинирани: Хеликобактер и поддръжка, добавки за Хеликобактер, Лабораторно поддържане, култура върху твърда среда, чувствителност към антибиотици.

В Колумбия в проучване, проведено от Universidad del Valle във финансиране с Колумбийския институт за развитие на науката и технологиите, те съобщават за разпространение на 69,1% от инфекцията от H. pylori в регионални болници на 16 департамента на Колумбия при биопсични проби, взети от ендоскопия на горния храносмилателен тракт. През предишните десетилетия изследванията върху причините за киселинната пептична болест и стомашния аденокарцином се фокусираха основно върху диетичните фактори, но откриването H. pylori като чест стомашен патоген е променил етиологичните концепции за тези и други гастродуоденални заболявания (5).

Изследването на H. pylori У нас започна в края на предходното десетилетие и има малко доклади на лаборатории с опит в микробиологичните умения, необходими за неговото изолиране и отглеждане (6).

МИКРОБИОЛОГИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Членове на рода Хеликобактер са описани през 1989 г., те колонизират стомаха и червата на хората и някои видове животни, това е извит, микроаерофилен грамотрицателен бацил, има външна мембрана и 4 до 8 полярни бичури, защитени от липидна структурна обвивка. Сред ензимите, които той произвежда, са: уреаза, каталаза и цитохром оксидаза. Уреазата е сред бактериалните фактори на вирулентност на H. pylori който превръща уреята в NH3 и вода, като по този начин алкализира околната киселинна среда; други фактори са представени в липаза, адхезини, каталаза, активиращ фактор на тромбоцитите, протеин на свързания с цитотоксин ген Cag A, pic B (който индуцира цитокини) и вакуолизиращ цитозин Vac A (3, 7).

За култура се вземат проби от стомашна лигавица и екстрагастрални проби, взети от зъбна плака, ректум, пикочен мехур и хранопровод; времето, необходимо за образуване на колонии, се получава между 4 до 7 дни при условия на: 5-10% 02; 5-10% С02; 80-90% N2, влажност 95% и температура от 35 до 37 ° C. Обикновено се отглежда в сложна среда с кръв, серум и антибиотици (7).

УСЛОВИЯ ЗА ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ

Препоръчителният протокол за вземане на биопсии при пациенти с хроничен гастрит е този, предложен от системата в Сидни. трябва да бъде отбелязано че H. pylori Намира се предимно в антралната част на стомаха, с изключение на лица, лекувани с ИПП и анти-Н2 антихистамини, където в тялото се откриват по-високи плътности. Трябва да се вземат 5 биопсии, както следва: две антрални проби от по-голямата и по-малката кривина на 2 до 3 сантиметра близо до пилора, две проби от тялото от по-голямата и по-малката кривина на 8 сантиметра дистално от кардията и проба, започваща от incisura angularis (8). Използвайки този протокол, бактериите могат да бъдат открити на практика при всички заразени индивиди (9). Взимането на биопсия е практически безболезнен процес за пациента, но това е процедура, която трябва да се извърши от експерт гастроентеролог, следвайки установени протоколи за медицинска етика. Процедурата не се препоръчва за пациенти с кървящи язви, тъй като може да представлява опасност от кървене. Всички изследвания трябва да бъдат одобрени от Комитета по етика и да имат ясно информирано съгласие.

Използвани са и други стомашни проби, като стомашен сок, получени чрез теста на струните ("тест на струни") и изолиране от повръщане, което дава различни резултати. H. pylori Понякога се култивира и от екстрагастриални проби като зъбна плака, хранопровод, ректум и пикочен мехур.

Аспекти, които трябва да се вземат предвид: ако пациентът е бил на антибиотици, е необходимо да се изчакат поне четири седмици след последната доза, за да се получат задоволителни резултати по отношение на културата. Форцепсът, с който се извършват биопсиите, трябва да бъде адекватно дезинфекциран, за да се избегне замърсяване между пациентите; ако дезинфекцията е твърде силна, това може да повлияе на жизнеспособността на бактериите.

Пробите за биопсия трябва да се смилат или пулверизират с малко количество физиологичен разтвор, преди да се приложат върху средата. Хомогенната проба трябва да се постави незабавно на повърхността на средата: тя трябва да се вземе с дръжка и след това да се разстила по повърхността с метод за разпръскване за изолиране (8, 9).

Получените проби трябва да бъдат обработени бързо, тъй като микроорганизмът е много чувствителен към околната среда. Пробите за биопсия (взети от антрума и от тялото) трябва да се поставят в стерилна епруветка с винтова капачка с 0,5 ml физиологичен разтвор и да останат там най-много 6 часа. Ако се очаква закъснение, трябва да се използват транспортни средства като среда на Стюарт и да се съхраняват при температура от 4 до 8 ° C за не повече от 24 часа преди обработката, след което се хомогенизират и засяват в два екземпляра в различни културни среди, включително бульон и агар Бруцела, BHI, Mueller Hinton, алумин от Колумбия и триптиказа от соя обикновено се допълват с фетален говежди серум, еритроцитен лизат, дрожден екстракт, пептон и цианобактериален екстракт. Кръв (кон, агнешко, заешко) обикновено се добавя между 7 и 10%, а сред антибиотиците, които се добавят към средата, са: ванкомицин, сулфаметоксазол, триметоприм, цефсулодин и полимиксин В. Пробите могат да се съхраняват в соев бульон от триптиказа или добавен BHI с 20% глицерол, които се съхраняват във фризер при -80 ° C или течен N2 (10-12).

Полезността и значението на културата за H. pylori Състои се в това, че може да познава характеристиките на растежа, генетичното му разнообразие, епидемиологията и възможността за определяне на бактериалната резистентност към антибиотиците, използвани при лечението (7, 13).

Tersterman et al (2001) описват използването на среда с определени субстрати (Hams F-12), която се използва за култивиране на клетки от бозайници. За изолацията на H. pylori Направени са модификации, които се състоят в допълването му с В-циклодекстрин, холестерол и фетален говежди серум без добавяне на кръв, което прави тази среда скъпа. Използва се традиционен кръвен агар и биопсични семена и референтни щамове на H. pylori, получаване на растеж в 100% от случаите (14).

Joo et al (2010), при създаването на тънкослойна система за течна култура за възстановяване на H. pylori чрез добавяне на бульон Бруцела В чашките на Петри с диаметър 90 mm, към които те добавят конски серум, екстракт от дрожди и диметил-бета-циклодекстрин, те получават време за генериране от 3,3 часа, отглеждайки този микроорганизъм експоненциално за 28 часа (15).

Stevenson et al. (2000) предлагат алтернативна хранителна среда, чийто основен компонент се състои от агар Columbia и смес от антибиотици, които инхибират придружаващото микробно натоварване като ванкомицин, амфотерицин В, триметоприм и цефулодин. Освен това той включва конска кръв, екстракт от месо, агар агар и царевично нишесте (16).

При засяване на проби от пилорен антрален и стомашен фундус върху агар Columbia, добавен със 7% дефибринирана агнешка кръв и селективна добавка DENT (ванкомицин, триметоприм, амфотерицин В и цефсулодин), е получена висока специфичност (100%), като се разглежда бактериологичната култура като злато доказателство (17).

Успешното отглеждане на Хеликобактер изисква използването на прясна агнешка или конска кръв в различните използвани агари. Комерсиално подготвените хранителни среди могат да работят, но тяхната свежест е трудно да се провери и те често могат да бъдат твърде стари или прекалено сухи, както и да нямат подходящи селективни антибиотици. След като агарите са приготвени, те не трябва да се използват веднага, те трябва да се държат в запечатани найлонови торбички при 4 ° C за не повече от 2 до 3 седмици (7). Гореизложеното беше потвърдено в нашето изследване, подчертавайки, че използването на агар Brucela, добавен с конска кръв (8%), предлага по-добро възстановяване в сравнение с агнешка кръв (8%) и че неговото консервиране трябва да се извършва при 4 ° C на максимално време от 20 дни.

В проучване, проведено от Yepes et al (2008), в което съпротивлението на H. pylori при пациенти от гастроентерологичната служба на болница Universitario San Ignacio (HUSI) получените проби първоначално се транспортират в стерилна епруветка с винтова капачка и се замразяват при -70 ° C за период от не повече от 3 седмици. Впоследствие пробата се размразява и култивира върху агар. Бруцела допълнено с 5% агнешка кръв и инкубирано в продължение на 5 дни във влажна микроаерофилна среда при 37 ° C (18).

При оценка на алтернативна транспортна среда, състояща се от бульон на Mueller Hinton, допълнен с екстракт от цианобактерии (MH-CE) и сравняването му със средата, бульон на Mueller Hinton, допълнен с телешки серум на плода (MH-FCS), беше получено, че възстановяването след 48 часа при стайна температура при MH-CE е по-висока (р по-малка или равна на 0,005), отколкото при MH-FCS. MH-CE среда е проста, евтина и може да се използва за запазване на жизнеспособността на H. pylori и възстановяването му от биопсии (19).

Trespalacios et al (2010) изолирани и идентифицирани H. pylori от стомашни биопсии, които са мацерирани в 1% разтвор на активен въглен, за да се получи хомогенен разтвор. Впоследствие те се засяват в модифицираната среда на Уилкинс-Чалгрен, допълнена с изовиталекс и антибиотици, които се инкубират в анаеробиоза при 37 ° С в продължение на 4-15 дни, като се получават 79 изолата и представляват 80% възстановяване (20).

Quiroga et al (2005), при култивиране на биопсични проби, получени от пациенти с гастродуоденални заболявания, които са били мацерирани в асептични условия и отглеждани в среда H. pylori (Lab M), с 8% добавка от конски серум, 1% isovitalex и селективна добавка за Campylobacter (Merck) отчете добри резултати при възстановяването на H. pylori (двадесет и едно).

Ин витро растеж на H. pylori изисква среда като бульон или агар Бруцела допълнено с витамини и конски серум или циклодекстрини. Течните среди обикновено показват бавен растеж. Чрез заместване на серума или циклодекстрините с търговски наличен разтвор на холестерол, оптимален растеж на H. pylori като алтернатива за възстановяването му от клинични проби (22).

Majalca et al (2001) оценяват GC основната среда (гел, шоколад) с 2% лиофилизиран хемоглобин, агар Campylobacter, Агар на Casman, агар от Колумбия, агар за инфузия на мозъчно сърце Бруцела, Агар Mueller Hinton и соев агар триптиказа, всички добавени със 7-10% конска или агнешка кръв, допълнена с антимикробни средства и със или без NAD (никотинамид-аденин) в концентрация 15 ug/ml. Микроаерофилната среда беше постигната с помощта на пликове, генериращи CO2 и с помощта на три таблетки Alkaseltzer в 10 ml вода в запечатана бутилка с парафилм, със или без свещ. Щамовете се съхраняват при -70 ° С като се използва бульон Бруцела добавяне на 10% конски серум, 25% глицерин и конска кръв, както и бульон Бруцела добавяне на 10% фетален говежди серум и 30% глицерол. Сред получените резултати се открояват следното: оптималната микроаерофилна среда, получена с трите таблетки Alkaseltzer. Културната среда, която показа най-добри резултати при възстановяването на H. pylori съответства на Casman агар със 7% конска кръв в продължение на 5-7 дни и най-добрата консервационна среда съответства на бульон Бруцела с 2% фетален говежди серум (23).

Чувствителността на хранителните среди варира в зависимост от различни променливи: събиране, транспортиране, съхранение на пробата, културална среда и условия на инкубация. Navarro et al (2007) оценяват екометричния метод за три хранителни среди: триптиказен соев агар, BHI агар и агар Бруцела, към която е добавена 5% агнешка кръв. Устойчивостта на трите медии към H. pylori е нисък и е корелиран с абсолютен индекс на растеж (ICA) под 2,5, което показва, че всички те нямат добър капацитет за възстановяване, вероятно поради ниска концентрация в кръвта и липсата на хранителни вещества като isovitalex (24).

Ръстът на H. pylori При липса на серум все още е трудно и някои хранителни нужди са само частично определени, тъй като аминокиселините, металите, натриевият хлорид за желязото, цинкът и магнезият са критични за растежа; медта не беше необходима. Тези данни показват това H. pylori и други Хеликобактер spp не са толкова взискателни, колкото се смяташе досега. Данните също така предполагат, че описаните химически дефинирани среди могат да генерират растеж на широк спектър от Хеликобактер spp, позволявайки по-подробна характеристика на неговата физиология и взаимодействия с клетки гостоприемници (25).

Mcnulty et al (2002) препоръчват използването на културна среда Wilkins-Chalgren-Бруцела, при възстановяването на H. pylori от стомашни биопсии, каталогизирани като селективна среда (26).

Miendje et al (2010), когато се оценяват три селективни среди (PYL-bioMérieux, Франция; Helicobacter agar-Beckton Dickinson, E.U и Brugman Helicobacter agar), използвани за възстановяване на H. pylori от стомашни биопсии те не откриха значителна разлика по отношение на броя на колониите и степента на възстановяване. Те наблюдават появата на типични колонии, които са идентифицирани с помощта на оцветяване по Грам и биохимични тестове като каталаза, оксидаза и уреаза (27).

култивиране

АНТИБИОГРАМА

За да се оцени чувствителността на H. pylori В сравнение с антибиотиците, референтният метод, одобрен от Института за клинични и лабораторни стандарти (CLSI), съответства на метода на разреждане на антибиотика в агар (28).

От друга страна, Британското общество за антимикробна химиотерапия препоръчва Е-тест (метод на епсилометър), който има добра корелация с референтния метод (10).

За теста за чувствителност се използва агар Muller Hinton, допълнен с 5% агнешка кръв. Инокулумът се приготвя в 0.85% физиологичен разтвор в сравнение с епруветка №2 от скалата на MacFarland (1x10 7 до 1x10 8 CFU/ml). За да се получи този инокулум, щамът трябва да бъде взет от 72-часова субкултура върху кръвен агар; по същия начин, като алтернатива, от култури от H. pylori След 2-3 дни инкубация, пригответе суспензия в бульон Бруцела коригирана по скалата на Macfarland (1 x 10 8 CFU/ml), които се инокулират върху плочи с агар на Mueller Hinton, допълнен с 10% конски серум и 2% isovitalex (20).

Като се има предвид, че методът за разреждане на агар не е рутинно приложим и методът на Е-теста е скъп и че несъответствия се наблюдават и при метронидазол, McNulty през 2002 г. провежда преглед на изследванията, при които се извършва дифузия с диск, като препоръчва:

Концентрация на диска и точки на рязане: за метронидазол се препоръчва използването на 5 µg диск и той се счита за устойчив, ако ореолът е 21 mm. При щамове с междинна чувствителност се препоръчва метод за определяне на MIC. За кларитромицин, използването на 2 µg диск се счита за устойчив, когато няма ореол за инхибиране. Диск с кларитромицин от 15 µg може също да се използва и да се счита за устойчив, ако ореолът е такъв