Оцеляване и заразност от метациклични форми на Trypanosoma cruzi в експериментално замърсена храна
Нестор Аньес *, Гладис Кризанте и Максимилиано Ромеро
Паразитологични изследвания J. F. Torrealba, Департамент по биология, Факултет на науките, Университет де Лос Андес, Мерида, 5101, Венецуела. * Автор-кореспондент: [email protected]
Записва се времето за оцеляване на метациклични форми на Trypanosoma cruzi, получени от храносмилателния тракт на Rhodnius prolixus, върху експериментално замърсена храна. Наблюденията между 1h и 18h след замърсяване разкриха наличието на изобилие и активни метацикли в замърсената храна през първите 6 часа, намалявайки тяхната популация около десетия час. Активността на метацикличните форми не показва разлики в храните, замърсени в твърда или течна фаза. По същия начин се демонстрира високата инфекциозност на Т. cruzi метацикли, които оцеляват в заразена храна след поглъщане от гръбначен гостоприемник.
Ключови думи: Trypanosoma cruzi, метацикличен, замърсяване, храна, оцеляване, инфекциозност.
Оцеляване и заразност на метацикличните форми на Trypanosoma cruzi в експериментално замърсена храна
Отчетено е оцеляването на метацикличните форми на Trypanosoma cruzi в замърсена храна. Наблюденията, проведени 1-18 часа след замърсяване на храната с метацикли от заразения Rhodnius prolixus, разкриват изобилие и активни бичури през първите 6 часа след замърсяването. Същата активност се наблюдава и при метацикли, поддържани върху течни или твърди замърсени храни. В допълнение се демонстрира заразността на оцелелите метациклични форми на T. cruzi в заразена храна след поглъщане от гръбначен гостоприемник.
Ключови думи: Trypanosoma cruzi, метациклично, замърсяване, храна, оцеляване, заразност.
Получава 29.11.2008 г. Приет на 03/11/2009
В предишна публикация, публикувана наскоро в тази среда, Añez & Crisante (2008) записват оцеляването на култивираните форми на Trypanosoma cruzi в експериментално замърсена храна. В него авторите посочват, че в 73% от плодовите и зеленчукови проби, използвани в техните експерименти, паразитите са останали живи за периоди между 6 и 72 часа след замърсяването, като по този начин се изчислява и най-големият брой живи бичове между 6:00 и 18:00. Въпреки че тези открития се отнасят до неинфекциозни форми на паразита, използваният метод и получените интересни резултати предлагат експериментална възможност, която може да бъде оценена чрез използване на инфекциозни форми от триатомини, заразени с T. cruzi. Този подход би позволил да се разбере какво може да се случи в райони, където болестта на Шагас е ендемична, когато триатомините, заразени от T. cruzi, колонизиращи домове или ги нахлуват от джунглата или перидомицилиарната среда, замърсяват храната, която остава изложена със своите заразени изпражнения. в битовата сфера, вътре или извън къщата, които накрая се поглъщат по различно време от жителите на една и съща.
Това проучване изследва оцеляването на метациклични форми на T. cruzi, събрани от експериментално заразени проби Rhodnius prolixus, след замърсяване на проби от плодове, зеленчуци, сокове и течно мляко с фекален материал, получен от ректалната ампула. По същия начин се регистрира инфекциозността на метацикличните клетки на T. cruzi, събрани от една от замърсените храни, излагайки лактиращите мишки на перорално поглъщане.
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
Изолиран от T. cruzi
Всички експерименти бяха проведени с помощта на изолат MHOM/Ve/92/2-92 на T. cruzi, получен от тежък остър случай на болест на Chagas от град La Maporita, щат Barinas, Венецуела. Преди това се характеризира молекулярно като T. cruzi I (Añez et al., 2004). Този изолат се поддържа в нашата лаборатория посредством периодични пасажи от експериментално заразени триатомини и/или мишки.
За извършване на експериментите са използвани възрастни образци на R. prolixus от колонията на ентомологичната лаборатория ? Herman Lent ?, Катедра по биология, Факултет на науките, Университет де Лос Андес, Мерида, Венецуела. Насекомите бяха погълнати от мишки, заразени с T. cruzi, показващи високи паразитомии. Веднъж заразени, триатомините се държат в инкубатор при 25 ° C и 70% относителна влажност, като често се изследват чрез микроскопско наблюдение на проби от екскременти, получени от всяко насекомо, до откриването на метацикличните форми (фиг. 1А). След като инфекцията бъде потвърдена, насекомите се дисектират, като се получава съдържанието на ректалната ампула, за да се пристъпи към преброяване на паразитите микроскопски, за да се изчисли броят на метацикличните форми на обем (фиг. 1Б).
В експериментите са използвани плодове и зеленчуци, на парчета 3 cm x 3 cm или натрошени, за да се получат соковете им, както и кокосова вода и течно мляко, разпределени в ½ литрови контейнери. Плодовите проби включват банан, пъпеш и лечоза, в двете им презентации на парчета и в сокове, докато от зеленчуците само доматите бяха представени и в двете форми, тъй като картофите и морковите, и двата варени, бяха поставени на парчета с посочения размер. Пробата от моркови беше елиминирана поради високото си първоначално замърсяване. Пробите на парчета бяха поставени в пластмасови контейнери (TC-Plate 6 гнездо, стерилна ? клетъчна звезда) с диаметър 3,5 cm във всяка ямка, правилно разделени и покрити (Фиг. 2). Пробите от сок, кокосова вода и мляко се съхраняват в стерилни пластмасови флакони от 5 ml с капачка с винт.
След като инфектираните триатомини бяха дисектирани, натрупването на чревно съдържимо се наблюдава в микроскоп Axioscope (Zeiss) с цел на фазов контраст при 400x, за да се открие и оцени количеството на Т. cruzi метациклични, присъстващи по обем (фиг. 1В). Получената концентрация на метациклични вещества се изчислява на 200/mL, като всяка проба се разпределя с обем 25 µL, еквивалентен на 5x10 3 метациклични вещества на замърсена проба (фиг. 2). Наблюденията на пробите се извършват 1, 3, 6, 10 и 18 часа след замърсяване с метацикличен T. cruzi. Те се състоят от вземане на аликвотна част от приблизително 5 µL с градуирана пипета на Гилсън с накрайник с фиксиран обем след внимателно разклащане на пробата, след което се пристъпва към поставянето й върху предметно стъкло за микроскопско изследване, както е посочено по-горе. Наличието на паразити във всяка проба е регистрирано качествено, както е посочено в предишна публикация (Añez & Crisante, 2008). По същия начин активността на метацикличните форми в положителните проби беше записана с цифрова видеокамера (Noticam 480), адаптирана към микроскопа Axioscop и свързана с компютър на HP с програмата Motic Images 2000 Версия 1.3.
Тестът за инфекциозност на метацикличните вещества се извършва, като се използват само замърсени проби от мляко, получени в аликвотни части от 50 ml 1, 3 и 6 часа след замърсяването. Всяка така получена проба се предлага орално на двойка сучещи мишки на възраст 5 дни за всеки път (фиг. 3). Кръвните проби от всяка мишка бяха изследвани микроскопски между 7 и 24 дни след инокулацията на инокула, съдържащ оцелели метацикли, за да се изследва тяхната инфекциозна способност. Наблюдението беше направено в два екземпляра върху свежи препарати от кръв, взети от опашката на всяка мишка, и от цитонамазки от кръвни проби, фиксирани и оцветени с 10% петно Giemsa във фосфатен буфер, рН 7,2. Освен това, за същата цел, сърдечните проби от някои от заразените мишки бяха подложени на специфичен PCR анализ за ДНК на T. cruzi (Sturn et al., 1989; Guhl et al., 2002).
Оцеляване на метациклици Trypanosoma cruzi в експериментално замърсена храна.
Микроскопските наблюдения, проведени между 1h и 18h върху проби от храни, предварително замърсени с T. cruzi метациклични, разкриха присъствието на тези бичурачи във всички форми на представяне на плодове, зеленчуци и течности, показващи активни движения и изместване, подобно на откритото. в оригиналния инокулум от чревното съдържание, присъстващо в ректалната ампула на R. prolixus. Като цяло, през първите 6 часа на наблюдение, в почти всички проби се забелязва изобилие от активни метацикли, което намалява около 10 часа след замърсяването. Наблюдението, съответстващо на час 18, показа активност, която може да бъде регистрирана в метациклиците само в пробата от кокосова вода; останалите проби по това време са силно замърсени от бактерии, откривайки само мъртви паразити в някои от тях. Таблица I подробно описва резултата от записа за оцеляването на метациклични вещества в различните замърсени храни, включително формата на представяне на пробата и активността, открита през целия период на наблюдение.
Инфекциозност на метацикли T. cruzi събрани от замърсено мляко
Микроскопски наблюдения върху кръвни проби, взети от новородени мишки, които са погълнали аликвотна част от мляко, замърсено с T. cruzi метацикли от заразени екземпляри от R. prolixus, разкриват наличието на кръвни трипомастиготи към 21 дни след поглъщането. Всички животни, които са погълнали храната в 1h, 3h и 6h след замърсяване с метацикли, несигурно са придобили инфекцията, която е била открита чрез двата използвани паразитологични метода (Таблица II). По подобен начин инфекцията е открита с помощта на PCR анализ, при който фрагмент от 330 bp се усилва, когато се използват праймери S35 и S36, което позволява част от генома на T. cruzi да бъде разкрита в сърцето на заразените мишки (фиг. 4).
Друг аспект от относително епидемиологично значение, разгледан в настоящата работа, е демонстрирането на инфекциозния капацитет, който T. cruzi метациклиците запазват, след като прекарват до 6 часа в замърсяване на изложени храни. По този повод използването на мляко, заразено с тази инфекциозна форма на паразита за хранене на лактиращи мишки, разкрива инфекция с T. cruzi при всички изложени животни. Този факт демонстрира инфекциозността на метациклиците, независимо от тяхната постоянност в продължение на 1h, 3h или 6h в замърсената храна, запазвайки типичната им агресивност, като показва изобилни циркулиращи трипомастиготни форми и инвазия в тъкани като сърце и скелетни мускули.
И накрая, едновременната демонстрация на оцеляването и заразността на Т. cruzi метацикли в замърсена храна предупреждава за възможността да има друг епидемиологично важен рисков фактор при предаването на инфекция Chagas в селските райони на Венецуела, предвид степента на адаптивност и ефективност към проникват в клетката гостоприемник, която има тази форма на паразита.
Авторите благодарят на лиценз Нестор Аньес-Рохас за неговото съдействие при изготвянето на ръкописа. Работа, финансирана по проекти FONACIT-G2005-000370 (NA) и FONACIT-G-2005-000387 (ON).
1. Añez N. & Crisante, G. (2008). Оцеляване на културните форми на Trypanosoma cruzi в експериментално замърсена храна. Bol. Mal. Salud Amb. 48: 91-94. [Връзки]
2. Añez N., Crisante G., Maia da Silva F., Rojas A., Carrasco H., Umezawa E. S., Stolf A. M. S., Ramirez J. L. & Teixeira M. M. G. (2004). Преобладаване на линия I сред изолатите на Trypanosoma cruzi от пациенти от Венецуела с различни клинични профили на остра болест на Chagas. Троп. Med. Int. Health. 9: 1319-1326. [Връзки]
3. Camandaroba E. L. P., Pinheiro Lima C. M. & Andrade S. G. (2002). Перорално предаване на болестта на Chagas: значение на биодемата Trypanosoma cruzi при интрагастралната експериментална инфекция. Rev. Inst. Med. Trop. Сао Пауло. 44: 97-103. [Връзки]
4. Crescente J. A., Valente S. A. S., Valente V. C. & Araújo J. A. (1992). Поява на 4 остри случая на болест на Chagas във vila de Icoarací-PA. Вижте. Soc. Brás. Med. Троп. 25 (Suppl. 1): 29 (res.062). [Връзки]
5. Crisante G., Rojas A., Teixeira M. M. G. & Añez, N. (2006). Заразени кучета като рисков фактор при предаването на човешка инфекция с Trypanosoma cruzi в Западна Венецуела. Act Trop. 98: 247-254. [Връзки]
6. DGE-MPPS (2007). Наблюдение на болестта на Chagas. Ръководство за диагностика, лечение и лечение на болестта на Шагас в острата фаза на ниво здравно заведение. 1-ви. Издание. Каракас Венецуела. [Връзки]
7. Диас-Унгрия С. (1968). Експериментално изследване на Trypanosoma cruzi при кучета и други гръбначни животни. Проблемът с предаването. Касмера. 3: 73-88. [Връзки]
8. Guhl F., Jaramillo C., Carranza J. C. & Vallejo G. A. (2002). Молекулярна характеристика и диагностика на Trypanosoma cruzi и T. rangeli. Дъга. Med. Res. 33: 362-370. [Връзки]
9. Sturn N. R., Degrave W., Morel C. & Simpson L. (1989). Чувствително откриване и шизодемна класификация на клетките Trypanosoma cruzi чрез амплификация на кинетопласт миникръжни ДНК последователности: използване при диагностициране на болестта на Chagas. Мол. Biochem. Паразитол. 33: 205-214. [Връзки]
10. Valente V. C., Valente S. A. S. & Pinto A. Y. N. (2001). Паразитологичен и серологичен профил на фамилна микроепидемия на болестта на Chagas в Abaetetuba, щат Пара. Преподобни Soc. Brás Méd. Троп. 34: 20-21. [Връзки]