енергията

  • Субекти
  • Обобщение
  • ЗАДЕН ПЛАН:
  • ЦЕЛ:
  • МЕТОДИ
  • РЕЗУЛТАТИ
  • ЗАКЛЮЧЕНИЯ
  • Въведение
  • материали и методи
  • Животни
  • Издръжка
  • експериментален протокол
  • Съдържание на тъканни протеини и биохимични измервания
  • Изотопни измервания
  • Генната експресия
  • Статистика
  • Резултати
  • Прием на храна, растеж на животни и състав на тялото.
  • Плазма урея, хормони и аминокиселини.
  • Състав на тъканите, скорости на протеинов синтез и генна експресия на протеолизния път.
  • Дискусия
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителна информация

Субекти

  • Метаболизъм
  • Затлъстяване
  • Протеолиза

Обобщение

ЗАДЕН ПЛАН:

Диетите с високо съдържание на протеини (НР) по време на ограничаване на енергията са широко проучени по отношение на способността им да намаляват телесните мазнини и да запазват чистата телесна маса, но малко се знае за ефекта им върху метаболизма на протеините в чистите тъкани.

ЦЕЛ:

Да се ​​определят ефектите от ограничаването на енергията и приема на протеини върху анаболизма и протеиновия катаболизъм при плъхове.

МЕТОДИ

В продължение на 5 седмици 56 мъжки плъхове Wistar са хранени с диета за индукция на затлъстяването (OI). След това те бяха подложени на 40% енергийно ограничение, използвайки OI диета или балансирана HP диета в продължение на 3 седмици, докато контролна група получи OI диета ad libitum (n = 8 на група). НР-ограничените плъхове бяха разделени на пет групи, които се различаваха само по отношение на източника на протеин: общ млечен протеин, казеин (C), суроватка (W), смес от 50% C и W и соя (n = 8). Животните бяха умъртвени в постпрандиално състояние и беше определен техният телесен състав. Скоростите на синтез на протеини се определят в черния дроб, гастрокнемиума и бъбреците, като се използва наводняваща доза подкожно 13 С валин. Нивата на MRNA са измерени за ключови ензими, участващи във всичките три пътя на протеолиза.

РЕЗУЛТАТИ

Ограничаването на енергията, но не и състава на диетата, се отразява върху загубата на тегло и затлъстяването, докато чистата тъканна маса (с изключение на бъбреците) не се влияе от състава на диетата. Нивата на неогликогенни аминокиселини са склонни да попадат под енергийно ограничение (P 1, 2 предполага променливи нива на енергийно ограничение и модификации в енергийното съдържание на хранителни вещества в диетите, като ограничаване на консумацията на мазнини или въглехидрати (СНО) и увеличаване на съдържанието на протеин. 3, 4 Протеините са във фокуса на конкретно проучване поради техния засищащ ефект, който може да намали енергийния прием 5 и да увеличи спазването на диетата от субекта.6, 7 Освен това диета, богата на протеини, може да намали до минимум загубата на чиста телесна маса калорична диета. 8, 9 Видът на протеиновия източник също може да окаже влияние, както се съобщава в модели на гризачи. 10, 11

Целта на това проучване беше да се разберат по-добре ефектите на диетичния състав на макроелементи, включително източника на протеин, върху телесния състав и метаболизма на тъканните протеини по време на ограничаване на енергията при плъхове.

материали и методи

Животни

Всички експерименти са проведени в съответствие с насоките на Френския комитет за грижа за животните и Европейската конвенция за гръбначните животни, използвани за експерименти. Мъжки плъхове Wistar (n = 56, 300-320 g) са закупени от Harlan (Horst, Холандия) и са настанени при контролирани условия на околната среда (температура, 12 часа тъмен период, започващ в 08:30). Плъховете имаха свободен достъп до вода и търговската лаборатория в продължение на 5 дни преди началото на диетичното им адаптиране към експерименталните диети.

Издръжка

Таблица в пълен размер

Диетите се доставят в полутечна форма, за да се избегне разлив и да се подобри записването на приетите количества. През последната седмица на ограничителния период плъховете свикнаха да получават храна по модел, който се състоеше от първи период между 08:30 и 09:30, който осигуряваше 1/3 от дневната дажба, и втори период между 12: 00 и 18:00 снабдяване с останалата част от дажбата. OI плъховете бяха подложени на същия график, но имаха свободен достъп до храна между 12:00 и 18:00. Този модел е приет, за да свикне животните да ядат стандартно хранене изцяло в рамките на период от 1 h на експерименталния ден.

експериментален протокол

Съдържание на тъканни протеини и биохимични измервания

Тъканите бяха лиофилизирани и претеглени. Общото му съдържание на N е оценено по метода на Дюма, като се използва елементален анализатор (Euro Elemental Analyzer 3000, EuroVector, Милано, Италия) с атропин като стандарт.

Общото съдържание на протеин (g) в тъканите се определя като P = TM ×% DM ×% N × 6.25/10 000, където TM е масата на мократа тъкан (g), а DM е сухото вещество.

Концентрациите на аминокиселини в плазмата се определят в депротеинизирани плазмени проби чрез йонообменна хроматография след колона с дериватизация на нинхидрин (Biotech Instrument, St Quentin-en-Yvelines, Франция). Концентрациите на инсулин и лептин бяха анализирани с помощта на ендокринен панел на плъхове (RENDO, Linco Research, Saint Charles, MI, USA) в система Bioplex 200 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). USA). Концентрациите на урея бяха определени с помощта на търговски комплект (Bio-Mérieux, Marcy l'Etoile, Франция).

Изотопни измервания

FSR (% на ден) на тъканните протеини се изчислява като FSR = Ebound val/(Efree val × t) × 100, където Ebound val и Efree val са обогатяване на 13C-валин без протеини в тъканите. Абсолютните скорости на синтез (ASR, g на ден) са изчислени като ASR = FSR × P, където P е общото съдържание на протеин в тъканта. Общата мускулна маса се оценява на 45% от телесното тегло. двайсет

Генната експресия

Общата РНК беше извлечена от замразена тъкан, използвайки реактиви TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Общата концентрация на РНК се определя количествено при 260 nm и се използва оцветяване с етидиев бромид, за да се потвърди целостта на РНК. Синтезът на комплементарната ДНК от първата верига (cDNA) се извършва в 400 ng РНК, като се използва комплект за обратна транскрипция (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Les Ulis, Франция) с термоциклер PTC-200 (изследване MJ, Waltham, MA, САЩ). PCR в реално време се провежда с помощта на „syber green power PCR master mix“ (Applied Biosystems) върху 7300 PCR система в реално време (Applied Biosystems). Грундовете са проектирани с помощта на софтуера Oligo Explorer 1.1.0 (GeneLink, Hawthorne, NY, USA). Последователностите на използваните PCR праймери бяха: 5'-ACACTGGCTCCTCAACCTG-3 '(напред) и 5'-TCCACCTTGATACCTCCTAAG-3' (назад) за катепсин D (NM_134334), 5'-CGCACCCTCTCTGACTACA-3 '(към гърба) '-GCCCTCTTTATCCTGGATCT-3 ′ (обратен) за убиквитин (Ubb, NM_138895), 5′-GGAAAACAAACGGGAGTATG-3 ′ (напред) и 5′-ACACAACGACGATGGAAAG-3 ′ (обратен) ензим за 14 kD-ензим E3 ензим (обратен) E3) и 5′-GAAGTAGAAGAAGGAGGTCG-3 ′ (реверс) за m-калпаин (NM_017116), 5′-GGGAGCCTGAGAAACGGC-3 ′ и 5′-GGGTCGGGAGTGGGTAATTT-3 ′ за 18S.

Всички PCR реакции се извършват, както следва: денатурация при 95 ° C в продължение на 10 минути, 40 цикъла на усилване с всеки цикъл се състоят от 15 секунди при 95 ° C, последвани от 1 минута при 60 ° C. Прагът на цикъла (CT) за всяка проба е определя се на праг на постоянна флуоресценция. Използвани са 18S амплификации на рибозомна РНК, за да се отчете променливостта в първоначалните количества на cDNA и вариациите между плаките се коригират с помощта на RT калибратор.

Експресията на гена беше определена с помощта на формулата 2 −ΔCt, където 2 представлява оптималната ефективност на PCR и целевия ген ΔCt = Ct - Ct 18S. Ефективността на PCR се определя на всяка плака, като се използва серийно разреждане на обратно транскрибираната РНК.

Статистика

Данните са изразени като средни стойности ± sd. Груповият ефект беше анализиран с помощта на еднопосочен ANOVA (версия 9.1; SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) и бяха извършени post hoc тестове на Tukey за множество сравнения. Ефектите от ограничаването на енергията и нивото на протеини бяха анализирани с помощта на изявления за контраст в модела, съответно в OI групи и ограничени групи. Ефектът на протеиновия източник се анализира в HP-R групите. За кривите на растежа данните бяха анализирани, използвайки смесен модел с време като повтарящ се фактор. P

Ръст на плъхове през 5-седмичния период на ОИ и по време на 3-седмичното енергийно ограничение. Средно ± sd (n = 8). За по-голяма яснота е представена само една HP-R група, поради липсата на разлика между ограничените групи. * значително различен от контролите (смесен модел с многократни измервания, post hoc тест на Tukey). OI, контролни плъхове, хранени с OI ad libitum диета; OI-R, енергийно ограничени плъхове на OI диета; HP-MP-R, енергийно ограничени плъхове под диетата на HP, съдържащи общ MP.

Изображение в пълен размер

Съставът на тялото е повлиян от ограничаването на енергията, докато съставът на макроелементите на диетите (т.е. ниво на протеин или източник на протеин) няма ефект (Таблица 2). Бъбрекът е единственият орган, в който нивото на протеин значително увеличава теглото. Ограничаването на енергията намалява мастните накладки, докато слабите тъкани са само незначително засегнати от ограничаването на енергията. Няма разлики в телесния състав между различните ограничени групи, независимо от нивото и естеството на протеиновото съдържание в диетата им.

Таблица в пълен размер

Плазма урея, хормони и аминокиселини.

Метаболитите и плазмените хормони се измерват 2 часа след хранене (Таблица 3). Уремията е била с 64% по-висока при плъхове с HP, отколкото при плъхове с OI (P

Концентрации на аминокиселини в плазмата, които са били повлияни от ограничаването на енергията, нивото на протеин и/или източника на протеин. Средно ± sd (n = 8). OI, контролни плъхове, хранени с OI ad libitum диета (черна лента); OI-R, енергийно ограничени плъхове на OI диета (отворена лента); HP-R, енергийно ограничени плъхове под диетата на HP (сиви ленти) с протеини от различни източници (MP; W; CW; C; S). Основните статистически ефекти са посочени във всяка графика: ограничение на енергията (ER), ниво на протеин (PL), източник на протеин (PS).

Изображение в пълен размер

Състав на тъканите, скорости на протеинов синтез и генна експресия на протеолизния път.

Съдържанието на протеин, FSR и ASR на черния дроб, гастрокнемиума и бъбреците са представени в Таблица 4. Констатациите във всички HP-R групи са обединени поради липсата на какъвто и да е ефект на източника на протеин. Ограничението на енергията и нивото на протеин не повлияват съдържанието на протеин и потоците на протеинов синтез в тези тъкани, оценени с помощта на FSR или ASR.

Таблица в пълен размер

В черния дроб диетата не модулира експресията на катепсин D, убиквитин, ензим Е2 и m-Калпаин (Фигура 3). За разлика от това, нивата на РНК на гените, участващи в пътищата на протеолиза, бяха значително увеличени чрез ограничаване на енергията в бъбреците и намалени от нивото на протеин в диетите с ограничена енергия за всичките четири ензима. Наблюдава се и ефект на протеиновия източник за убиквитин, ензим Е2 и М-калпаин, с тенденция към по-високо ниво на експресия в групата на МР в сравнение с Cas и S. В мускулите на гастрокнемия експресията на гени на протеолиза Ензими ( с изключение на катепсин D) са склонни да се увеличават с ограничаване на енергията, докато нивото на HP драстично намалява експресията на всичките четири ензима.

Относителна експресия на гени на протеолизния път (катепсин D, убиквитин, Е2 ензим, m-калпаин) в черния дроб, гастрокнемиусния мускул и бъбреците при плъхове след ограничаване на енергията в продължение на 3 седмици. Средно ± sd (n = 8). OI, контролни плъхове, хранени с OI ad libitum диета (черна лента); OI-R, енергийно ограничени плъхове на OI диета (отворена лента); HP-R, енергийно ограничени плъхове под диетата на HP (сиви ленти) с протеини от различни източници (MP; W; CW, смес от C и W; C; S). Основните статистически ефекти са посочени във всяка графика: група, ограничение на енергията (ER), ниво на протеин (PL), източник на протеин (PS).

Изображение в пълен размер

Дискусия

Това проучване показа, че при плъхове, подложени на 40-45% ограничение на енергията, загубата на тегло и телесният състав се влияят главно от ограничаването на енергията, докато диетичният състав и източникът на протеини нямат значителни ефекти. Нивото на НР подобрява циркулиращата глюкоза и липидите в кръвта, докато ограничаването на енергията само намалява свободните мастни киселини. Нивото на HP противодейства на тенденцията към увеличаване на циркулиращите неогликогенни аминокиселини в резултат на ограничаване на енергията. Степента на синтез на протеини не се влияе нито от енергийното ограничение, нито от диетичното ниво на протеини, докато в бъбреците и мускулите ключовите протеолизни ензими са свръхекспресирани при енергийни ограничения и са слабо изразени, когато нивото на протеина се повиши. Тези модулации на пътищата на протеолиза обаче не повлияват загубата на чиста маса, независимо от съдържанието на протеини в диетата.

В заключение, при възрастни затлъстели плъхове, подложени на 40% енергийно ограничение в продължение на 3 седмици, тяхното тегло и загуба на мазнини се определят само от приема на калории, независимо от състава на макроелементите. Чистата маса се запазва независимо от нивото на протеина и белтъчният метаболизъм е повлиян само леко, с изключение на протеолизните пътища в мускулите и бъбреците, където всяко активиране след хранене чрез ограничаване на енергията се противодейства от ниво на HP. И накрая, когато нивото на протеин беше високо, всички източници на протеин бяха еквивалентни по отношение на техните ефекти.