РЕЗЮМЕ

Достъпът е предоставен от

ВЪВЕДЕНИЕ

Нитрофураните са група от мощни широкоспектърни антибактериални лекарства, които притежават и антипротозойна активност. Те все още се използват за лечение на много бактериални и протозойни инфекции при животни за производство на храни по целия свят, особено прасета и домашни птици, и са способни да предизвикат рак, както и да имат други токсични странични ефекти при различни експериментални модели. 1, 2, 3 Тези доказателства са взети като основа за забрана на употребата им в здравето на животните в много страни.

Към края на 80-те, въз основа на идеята за предотвратяване на достигането на канцерогенно вещество до потребителите на човека съгласно поправката от Дилейни, Американската администрация по храните и лекарствата забрани употребата на фуразолидон (FZD) и нитрофуразон (плюс късно удължен до фуралтадон) за лечение на болести при животни за производство на храни. От гледна точка на САЩ и чужбина обаче е възможно да се постави под съмнение тази забрана. Индукцията на рак е установена при лабораторни животни, получаващи директно големи количества от даден нитрофуран; 1, 2, 4, но хората не са в опасност да консумират агента нитрофуран от животински източници на храна, а остатъци от основните метаболити: 2,3-дихидро-3-цианометил-2-хидрокси-5-нитро-1 алфа, 2 -ди (2-оксо-оксазолидин-3-ил) иминометил-фуро 2, 3- β фуран, наричан още 3-амин-2-оксазолидон (AOZ), и второстепенен метаболит, N- (5-амино -2- фурфурилиден) -3-амино-2-оксазолидон (FOZ). 5, 6 Към днешна дата доказателствата, че AOZ/FOZ може да предизвика генотоксични или канцерогенни промени, не са категорични.

Както при бозайниците, рибите метаболизират FZD в AOZ и FOZ чрез цитохром P -450; следователно те могат да се използват за изследване на канцерогенните ефекти, които FZD и неговите метаболити AOZ/FOZ могат да предизвикат. 7 Известно е, че вид декоративни гиногенетични риби, Poecilia formosa (mollies), чиито родители и потомци са генетично идентични, са склонни към развитие на тумори, отчасти поради особения им репродуктивен процес. 8 Този вид се счита за подходящ модел за тестване на канцерогенния потенциал на лекарствата, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и може да се използва за изследване на преките канцерогенни ефекти на FZD, както и косвените ефекти . от AOZ. Освен това е направено сравнение на такива ефекти при тилапия (Oreochromis niloticus).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Моли (Poecilia Formosa)

Използвани са общо 1350 молиса, всеки с дължина 2 см и тегло приблизително 1,2 g. Рибите бяха разпределени в 40 литра стъклени съдове с воден оборот 50% седмично. Обем от 1 L въздух/мин (Wave Pumps, W Lim Corporation, El Monte, CA, USA) се изпомпва във всяка, за да се поддържа концентрация на кислород във водата от 5 ppm. Температура на водата от 23 ° C се осигурява с термостат. Водните променливи (кислород, температура и рН) се измерват ежедневно (Digital Oximeter and Precision Thermometer, American Marine Inc., Ridgefield, CT, Cherstertown, MA, USA). Съдържанието на амоний, нитрит, твърдост на водата и фосфати се измерва чрез автоматизирана система (Aqua LaMotte, Cherstertown, MA, USA).

В група Am, три повторения от 100 mollies са лекувани с 11 mg FZD/kg фураж/ден в продължение на 12 седмици. Всяка седмица седем молиса на реплика се демедулират и се съхраняват в 10% буфериран формалдехид. Взетите проби от риба се обработват за хистопатологичен анализ, като се използва стандартно вграждане и оцветяване с восък с хематоксилин-еозиновата техника. Включена е контролна група (Am control) от 100 нелечебни моли. В група Bm, 300 третирани с FZD жени получиха същата доза, както преди, и бяха разделени на три повторения и стимулирани за възпроизвеждане с гупи (Poecilia reticulata) в края на седмица 12. Контролна група също беше създадена без лечение на 100 mollies и индуциран за разплод, както по-горе (контрол Bm). Малките от групите Bm и контролните Bm са хранени със стандартна търговска диета, без FZD, и след като достигнат размера от 1 cm, 20 риби се умъртвяват на реплика и се обработват както по-горе за хистопатологичен анализ.

В групата на Cm 350 mollies, хранени с FZD, се превръщат в рибно брашно след 12 седмици прием на лекарства с 11 mg FZD/kg фураж. Това рибно брашно е включено в търговски фуражи без време за екстракция в размер на 500 g рибно брашно/kg търговски фураж. Общо 100 mollies (Cm 1 група) са хранени с тази дажба в продължение на 12 седмици. Изчислената доза AOZ е 1,25 μg/kg биомаса от мекотели, като се има предвид консумацията на фураж от 5% от теглото на биомасата. В края на този период рибите са обработени, както е описано по-горе, в търсене на тумори. Беше установена и нелечебна контролна група от 100 mollies (контролна Cm).

Тилапия (Oreochromis niloticus)

Общо в тази фаза са използвани 325 младежки мъжки тилапии с размер 2 см. В група At бяха включени 65 риби на реплика и три реплики, плюс 65 допълнителни риби за нетретираната контролна група (контролна At). Животните бяха разпределени, както вече беше описано. Рибата е получила търговска диета, допълнена с FZD в доза от 50 mg/kg фураж за 60 дни. В края на този период приблизително половината от тези риби са заклани и обработени за макроскопски и хистопатологичен анализ, както вече беше описано. Другата половина е направена от рибно брашно и е включена в търговска диета в размер на 500 g/kg търговски фураж. Изчислената доза AOZ е 1,6 μg/kg биомаса от тилапия, като се има предвид консумацията на фураж от 5% от теглото на биомасата. Bt групата от 65 тилапия е хранена с тази диета, съдържаща остатък от FZD в продължение на 12 седмици, като AOZ/FOZ форма на лекарство. Контролните данни в групата без медикаменти също се считат за контролна група за групата Bt.

Разпределението на групите в двата вида риби е обобщено в таблица 1.

Таблица в пълен размер

Рибното брашно от мекотели и тилапия е обработено за откриване на AOZ и FOZ, както е описано от Conneely et al 16 в три екземпляра, като се използва разделителна колона от Inertsil ODS (150 × 4.6 mm ID) и 5 ​​mM оксалова киселина-ацетонитрил (55: 45) като мобилен. Фаза с UV-vis детекция при 265 nm (0,04 aufs).

Статистическият анализ на данните беше извършен с помощта на непараметричния точен вероятностен тест на Fisher.

РЕЗУЛТАТИ

Оценените физикохимични променливи се поддържат постоянни във всички тестове с двата вида, със следните средни стойности: температура 23,66 ± 1,2 ° C; рН 6,7 ± 0,6; амоний 0,730 ± 0,09 mg/l; фосфати 3,0 ± 0,5 mg/l; нитрати 0,41 ± 0,5 mg/l; кислород 5,6 ± 0,2 mg/l и твърдост на водата (измерено за съдържание на калций) 120 ± 6,5 mg/l.

HPLC анализът разкрива присъствието на AOZ в рибно брашно, приготвено с моли и тилапия, в количества съответно 25 ± 8,5 и 32 ± 4,8 µg/kg. В двете проби от рибно брашно са открити само количествено измерими следи от FOZ. Тези концентрации на AOZ позволяват дози на AOZ, еквивалентни на 1,25 μg/kg биомаса от моли и 1,6 μg/kg биомаса от тилапия.

Моли (Poecilia Formosa)

Хистопатологичните изследвания на моли разкриха ясна индикация за чернодробна стеатоза във всички проби от риби, третирани с FZD. Контролните животни не показват такова нараняване. От 3-та седмица до края на проучването се наблюдава ясно увеличение на меланохистоцитомите на черния дроб, панкреаса, бъбреците и половите жлези при риби, лекувани с FZD. Фигура 1а и б показват някои примери за тези констатации. Седмичната честота на представяне на бъбречния (а) и/или чернодробния (б) меланохистоцитомен тумор е както следва: нито една през първите 2 седмици, след това 10, 24, 30, 36, 36, 44, 46, 48, 46 и 44, съответно от 3-та до 12-та седмица. Точният тест за вероятност на Fisher показва, че в сравнение със седмици 1 и 2 и контролната група, групата, лекувана с FZD, има статистически значимо увеличение на туморите от седмица 3 до седмица 12 (P

ефекти

Бъбречни (а) и чернодробни (б) меланохистоцитоми, индуцирани от моли, хранени с FZD (Poecilia formosa) при 0,011 g/kg фураж/ден в продължение на 12 седмици.

Изображение в пълен размер

Тилапия (Oreochromis niloticus)

Не са наблюдавани тумори в нито една от рибите, лекувани с FZD, или при храненето с тилапия, хранено с тилапия. За разлика от това, чернодробна стеатоза е установена при всички лекувани с FZD тилапия. Нелекуваните контролни риби не показват тази лезия.

ДИСКУСИЯ

Физикохимичните променливи, оценени във водата, не се променят съществено при нито един набор от тестове. Следователно се стига до заключението, че много малките наблюдавани колебания е много малко вероятно да окажат влияние върху наблюдаваните резултати. Експерименталната канцерогенеза, използваща видове риби като алтернативни модели, е описана като динамична, привлекателна и ценна област на изследване. 11, 12 Poecilia formosa е женска линия от живи риби, които претърпяват чести мутации, притежават клонално предаване и най-малко два наистина хипервариативни локуса, които поддържат концепцията, че молиците са склонни към мутационни промени както от физически, така и от химически стимули. 13, 14, 15 Всъщност този вид риба се счита за по-изгодна от използването на гризачи за тестване за потенциални канцерогени. Следователно резултатите от това проучване подкрепят използването на този вид риба за откриване на потенциално канцерогенни вещества.

Основна цел в този експеримент беше да се сравнят/противопоставят ефектите от храненето на FZD или AOZ/FOZ в два модела риби: един, склонен да развива тумори (Poecilia formosa), и втори (Oreochromis niloticus), който не се отличава с това. Освен това, в случая на моли, бяха тествани последователни поколения, за да се оцени възможно натрупване или геномно въздействие върху зародишните клетки. Както се очаква, събраните от тази следа доказателства са в съответствие с установения факт, че FZD е канцерогенно вещество. 1, 2, 4, 17, 18 В това конкретно проучване, FZD-индуцираният тип рак се определя като меланохистиоцитом. Тези тумори стават по-очевидни и обилни с времето на излагане на FZD. За разлика от тях, нито един от тези тумори не е открит при моли или тилапии, хранени с AOZ/FOZ, заразени съответно с моли или брашно от тилапия, нито в потомството на моли, които са преживели 12-седмичен период на лечение с FZD.

Предизвикателството, проектирано тук, като се използват метаболити, свързани с протеина FZD, се извършва при концентрации на AOZ/FOZ в рибните ястия (от моли и тилапия), значително по-високи от отчетените концентрации на AOZ в месо от прасета от животни, лекувани с FZD. 19 Това може да се обясни поради процеса на дехидратация, необходим за приготвянето на рибното брашно. Тази методология се различава от простото добавяне на AOZ към фуража, тъй като се смята, че AOZ от животни, лекувани с FZD, е ковалентно свързан с тъканните протеини, като по този начин прилича на хранителната верига по по-точен начин.

Допълнителна цел на този експеримент беше да се оценят ефектите от натрупването на метаболити на FZD в хранителната верига в следващите поколения. В това проучване не може да бъде открит различим ефект. Всъщност липсата на способност за индуциране на тумори на AOZ/FOZ, открита в тези анализи, поне за моли и тилапия, по-добре отговаря на проучванията, показващи липсата на мутагенност на AOZ, свързан с тъкани със или без метаболитно активиране и използване на тест за салмонела/микрозома, 20 отколкото с предварително изчисленото предположение, че AOZ/FOZ е потенциално толкова токсичен за клетките, колкото FZD. Klee et al 21 не откриват остра токсичност на AOZ или остатъци от храносмилането в чревни сегменти и Caco-2 клетки при концентрации, които са значително над максималните нива на остатъци, очаквани в храни от животински произход след прилагане на терапевтични дози. За да се установи обаче с по-голяма сигурност дали AOZ/FOZ е безопасен за потребителите, би било полезно да се повтори този тест, като се използват по-големи количества пречистени и свързани с протеини AOZ и FOZ, както и да се увеличи времето на експозиция. към тези агенти.

Меланохистиоцитомите са доброкачествени тумори на меланомакрофагичните центрове. Тези центрове са перфектно капсулирани от влакнеста съединителна тъкан, главно в черния дроб и в различни органи като панкреаса и бъбреците. Известно е, че тези клетки имат висока скорост на клетъчно делене; следователно неговата онкогенна отговорност става по-голяма. Това изглежда вярно за Poecilia formosa, вид, който се нуждае само от 3 седмици излагане на FZD, за да развие такива тумори. Въпреки че комбинираните метаболити на AOZ/FOZ поддържат само незначителни промени в тяхната химична структура, те са достатъчни, за да изключат драстично канцерогенната активност на FZD.

Стеатозата е често срещана находка при всички третирани с FZD риби, както тилапия, така и моли, но тази находка не се наблюдава в контролните групи. Процентът на мазнини в храната е адекватен, т.е. 8% за моли и тилапия. Тъй като контролната риба не е показала стеатоза, малко вероятно е смилаемостта на източника на мазнини в търговския фураж да е частично отговорна за това увреждане. 22, 23 За разлика от това е показано, че FZD е способен да предизвика такива промени. Въпреки това е малко вероятно стеатозата да има някаква връзка с индуциращите тумора свойства на FZD или липсата на този ефект, наблюдавана при AOZ/FOZ.

При тилапия нито относително голямата доза FZD за 90 дни, нито замърсеното с AOZ/FOZ брашно от тилапия не предизвикват откриваеми тумори. Тези резултати също така предполагат, че FZD не е канцерогенен за животни, произвеждащи храни, когато се използва в терапевтични дози и за разумно ограничен период от време. Всъщност изчерпателният преглед на литературата, подпомогнат чрез автоматизирани бази данни, не разкри нито едно позоваване на директен туморен индуциращ ефект на FZD при видове, произвеждащи храни.

Рибите, които се дозират с добавка на FZD и след това се използват за производство на рибно брашно за хранене на други риби, изглеждат достатъчна стъпка, за да лишат FZD от нейните индуциращи рака свойства. Това становище е в съответствие с последните доказателства, които поставят под въпрос опасността, която FZD може да представлява за човешкото здраве, когато се използва като фуражна добавка във ветеринарната медицина. 22 Тези резултати могат да бъдат измерени в страни, в които нитрофураните все още се използват в здравето на животните и чиито правителства все още разглеждат тези агенти. Прилагането на тези резултати за оценка на рисковете за потребителите обаче не е предмет на проучването и е отговорност на регулаторните агенции в съответните държави.