Внимание: Тази страница е превод на тази страница първоначално на английски. Моля, обърнете внимание, тъй като преводите се генерират от машини, не че всички преводи ще бъдат перфектни. Този уебсайт и неговите страници са предназначени за четене на английски език. Всички преводи на този уебсайт и неговите уеб страници могат да бъдат неточни и неточни изцяло или частично. Този превод е предоставен за удобство.

пречистване

Техниките за протеиново инженерство са съществена част от персонализирането или производството на протеини със специфични свойства, които могат да бъдат приложени в различни индустриални процеси. По този начин те са от решаващо значение за биотехнологичните изследвания.

Тези методи обаче разчитат до голяма степен на способността да се изолират и пречистят желаните протеини, за да се разберат техните физични и химични свойства, заедно с техните третични структури и взаимодействия с лиганди и субстрати.

Интензивността, с която се преследва този процес на пречистване, зависи от употребата на протеина. Например, фармацевтичните и хранителните протеини трябва да бъдат доведени до наклон с висока чистота и да преминат през няколко последователни стъпки, уникално възможни, тъй като във всяка стъпка неизбежно ще се загубят някои протеини.

Пречистването на протеиновите молекули е по-просто от пречистването на протеиновите комплекси.

Стъпка 1: Създайте екстракт от суровия протеин

Суровите екстракти от вътреклетъчни протеини се приготвят чрез лизиране на клетката с помощта на химични или механични процеси. След това отломките се отстраняват чрез центрофугиране. Полученият супернатант е далеч от чистата форма, смесен е с много други макро и микромолекули.

Извънклетъчните протеини се получават чрез центрофугиране на разтвора и отстраняване на клетките. Специфичен метод за получаване на суров екстракт от термостабилни ензими е нагряването на сместа, за да денатурира други протеини, и след това да се охлади, за да реформира термостабилните протеини от интерес, като накрая се центрофугира, за да се отстранят денатурираните протеини.

Стъпка 2: междинно пречистване

Осоляване

След това протеините в суров екстракт се пречистват чрез утаяване във силно концентриран солен разтвор, като амониев сулфат. Това работи въз основа на по-ниската разтворимост на протеина при високи концентрации на сол. Всички протеини обаче не се утаяват при една и съща концентрация на сол, което означава, че осоляването помага и за разграждането на протеините. Може да се използва и за концентриране на протеини в разтвор. Тази стъпка увеличава чистотата три пъти и 92% от протеина в разтвора се възстановява.

Диализа

Протеините са големи молекули и това означава, че солите на протеините ще бъдат запазени чрез преминаване на разтвора през полупропусклива мембрана. Целулозата е типична диализна мембрана. Диализата не може да се използва за разделяне на протеини с различно молекулно тегло.

Хроматография

Други техники, използвани за отстраняване на солени протеини, включват хроматография и филтриране с изключване на гел. Те вече се предлагат като готови комплекти за много стандартни протеини и често са подходящи за широкомащабни процеси.

Гел филтрацията работи въз основа на разделянето на размера през колона от порести форми на полимера, като декстран или агароза. Големите молекули могат да протичат само през пролуките между тапицерията, докато по-малките молекули заемат тези пролуки и пространството в тапицерията, намалявайки ги. По този начин елуентът съдържа нововъзникващите молекули в реда на техния размер, от най-големия до най-малкия. Използват се и техники за хроматография с обратна фаза или йонообмен, действащи въз основа на диференцирани хидрофобни свойства и съответно заряд. Обратната хроматография може да бъде ограничена при използването й поради възможна денатурация на протеина от органични разтворители.

Диализата и йонообменът водят до разтвор, който е 9 пъти по-чист, но само с 77% от първоначалния протеин, който вече е на разположение. След хроматография за изключване с гел добивът е само 50%, но чистотата е сто пъти.

Стъпка 3: Окончателно пречистване

Афинитетна хроматография

Този процес зависи от използването на свързани лиганди за гранули, които специфично се свързват с протеина от интерес, който след това може да се изплакне с друг разтвор на свободни лиганди. Това води до изключително чисти протеинови проби, които имат най-висока специфична активност сред всички техники, които се използват в момента. Пример за това е пречистването на конканавилин А, като се използват остатъци от глюкоза, прикрепени към зърната в колона. Решението сега е най-чистото 3000 пъти, но добивът е само 35% от първоначалния протеин.

Електрофореза в полиакриламиден гел

Електрофорезата с полиакриламиден гел се използва за откриване на чистотата на протеиновата проба след всяка стъпка въз основа на размера. Нетният заряд върху молекулата кара колоната или листът на гела да спаднат в електрическо поле, което позволява на протеините да се отделят въз основа на тяхната миграция, което от своя страна зависи от техния заряд, както и от триенето и силата на полето. Гелът действа като химически инертен и лесно формиращ се филтър, като протеиновите молекули са почти неподвижни в колоната, тъй като те се придържат между много по-малките пори между молекулите на гела. Първоначално се визуализират серия ленти, представляващи различни протеини в сместа, които постепенно намаляват в голям брой, докато последната стъпка покаже само една лента.

Имуноблотинг

Имуноблотингът е друга полезна техника, често комбинирана с афинитетна хроматография. Той използва антителата, така че протеинът да бъде изолиран като лиганди в колоната. Понякога антитялото се подлага на изотопи или багрила, за да ги маркира и да улесни откриването след разделянето.

Всяка хроматографска техника се усъвършенства, като се използва налягане, за да се принуди разтворът да се прокара през колона от фино разделени материали, натоварени или закрепени с лиганд форми. Увеличаването на повърхността води до най-голямо взаимодействие, което увеличава разделителната способност и скоростта на техниката. Това се нарича високоефективна течна хроматография (HPLC).

Всички тези стъпки са включени в идеалната схема, която трябва да се съсредоточи върху нивата на добив и пречистване, за да осигури адекватни количества протеин, за да премине през експеримент, както и да предложи достатъчна чистота, за да направи интерпретацията сравнително ясна.

Препратки

Допълнителна информация

Д-р Лиджи Томас

Д-р Лиджи Томас е специалист по гинекология, завършил Правителствения медицински колеж, Университет в Каликут, Керала, през 2001 г. Лиджи практикува като редовен консултант по акушерство/гинекология в частна болница няколко години след дипломирането си . Тя е консултирала стотици пациенти, които се сблъскват с проблеми, свързани с бременност и безплодие, и е отговаряла за над 2000 раждания, като винаги се стреми да постигне нормално раждане, а не оперативно.

Цитати

Моля, използвайте един от следните формати, за да цитирате тази статия във вашето есе, доклад или доклад:

Томас, Лиджи. (2019, 26 февруари). Техники за пречистване на протеини. Новини-Медицински. Получено на 12 януари 2021 г. от https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

Томас, Лиджи. "Техники за пречистване на протеини". Новини-Медицински. 12 януари 2021 г. .

Томас, Лиджи. "Техники за пречистване на протеини". Новини-Медицински. https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx. (достъп до 12 януари 2021 г.).

Томас, Лиджи. 2019. Техники за пречистване на протеини. News-Medical, гледано на 07 януари 2021 г., https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

News-Medical.Net предоставя тази медицинска информационна услуга в съответствие с тези условия. Моля, обърнете внимание, че медицинската информация, която се намира на този уебсайт, е предназначена да подкрепя, а не да замества връзката между пациент и лекар/лекар и медицинските съвети, които те могат да предоставят.

News-Medical.net - сайт на AZoNetwork