стрептококи

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Филогенетичен анализ на ензими от семейството на гликозил хидролазата 70
  • Картографиране на геномното местоположение на гените от семейство гликозил хидролаза 70
  • Филогенетичен анализ на каталитичния домен в стрептококови GTF
  • Филогенетичен анализ на свързващия глюкан домен в стрептококови GTF
  • Дискусия
  • Методи
  • Гликозил хидролазна фамилия 70 последователности
  • Търсете хомология и семейство протеини
  • Филогенетичен анализ
  • Картографиране на геномното местоположение на гените от семейство гликозил хидролаза 70
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

Субекти

  • Микробиология на околната среда
  • Микробна генетика
  • Молекулярна еволюция
  • Патогени

Обобщение

Придобиването на способността да произвежда полизахариди от захароза, т.е. gtf генът, кодиращ глюкозилтрансфераза (GTF), е ключовото еволюционно събитие, което позволява образуването на зъбни биофилми от стрептококи. За да изясним родословието на стрептококови GTF, времето на тяхното появяване и реда на конкретни събития, ние изследвахме разпределението на GTF сред бактериите, използвайки филогенетичен анализ на ензими от семейство 70 гликозил хидролаза. Открихме, че стрептококовите GTF са получени от други млечнокисели бактерии като Lactobacillus и Leuconostoc, и предлагаме следния еволюционен модел: хоризонтален трансфер на гени чрез транспозони е възникнал, когато стрептококите са срещнали млечнокисели бактерии, съдържащи се във ферментирали храни. Интрагеномното дублиране на гени е причинено от вторично селекционно налягане, като консумация на рафинирана захар. Нашите открития за тази еволюция при Streptococcus mutans осигуряват важен фон за изследване на връзката между историческото разпространение на зъбния кариес и антропологичните фактори.

Въведение

При хората зъбният кариес се определя като деминерализация на зъбите чрез бактериално производство на органична киселина от ферментиращи субстрати като монозахариди, олигозахариди и преработени полизахариди 1, 2, 3. Пандемията на зъбния кариес вече е обсъждана от антропологична и археологическа гледна точка по отношение на консумацията на ферментиращи въглехидрати 4, 5, 6, 7. Всъщност появата на зъбен кариес е положително свързана с повишената консумация на въглехидрати чрез основния източник, зърно 8, 9, след появата на праисторическото земеделие. По това време степента на кухините е относително лека, тъй като оралните бактерии произвеждат само малки количества органична киселина. Широкото използване на рафинирана захар по време на индустриалната революция поради подобрения в техниките за преработка на храни, стабилизиране на доставките на захарна тръстика на основата на плантации и премахването на Закона за царевицата 10 доведе до внезапно увеличаване на разпространението на кухините.

Досега само антропологични фактори, като описаните по-горе, са били взети предвид при развитието на зъбен кариес при хората, докато факторите, които засягат болестотворните бактерии, са пренебрегвани до голяма степен. Това може да се основава на твърдото убеждение, че бактериите, причиняващи кариеси, са предшествали развитието на кухини. Понастоящем обаче няма изследвания, които да описват произхода на бактериите, причиняващи кариеси. Днес Streptococcus mutans се счита за основната причина за зъбен кариес. Тези бактерии имат способността не само да метаболизират големи количества киселина от различни захари, но и да прилепват здраво към зъбната повърхност, използвайки адхезивни глюкани, произведени от захар, рафинирана от глюкозилтрансферази (GTF) 11. Това последно свойство на бактериите, причиняващи кариес, е основната характеристика, която отличава праисторическия кариес от съвременния кариес.

Резултати

Филогенетичен анализ на семейство гликозил хидролаза 70 ензими

За да се определи произходът на гените, които допринасят за кариогенния потенциал на Str. Mutans, са конструирани 3 филогенетични дървета от ензими от семейството на гликозил хидролазата 70 (допълнителна таблица S1), използвайки методите NJ, ME и MP. Дървото, генерирано по метода MP, е показано на фигура 1, а останалите 2 са представени в допълнителна информация. Получените 3 дървета показаха пълна конгруентност. Стрептококовите GTF ензими проявяват хомология с Leuconostoc декстрансукрази и Lactobacillus и Lactococcus GTF, което предполага общо произход за гените, кодиращи тези ензими.

Филогенетично дърво на аминокиселинните последователности на гликозил хидролазната фамилия 70 ензими е конструирано, използвайки метода на максимален парсимон (MP). Гените в скоби с удебелени линии са съседни един на друг в бактериалния геном. Стойността във всеки клон е прогнозната граница на доверие (изразена като процент) за позицията на клоновете, определена от анализа на началната лента. Показват се само стойности над 50%.

Изображение в пълен размер

Картографиране на геномното местоположение на семейство Гликозил хидролаза 70 гена

Областите нагоре и надолу по веригата на gtf гените на 4 вида бактерии са показани на фигура 2А. Транспозазните последователности са наблюдавани в горните и/или долните области на Lactobacillus reuteri gtf 180 и Lactobacillus sakei gtf Kg15. Streptococcus oralis gtfR надолу по веригата също показва хомология на последователността със стрептококови гени за транспозаза (фиг. 2В). Идентичността между този регион и транспозазните гени на Str. Pneumoniae, Str. Suis, Str. Gordonii и Str. Mitis, показва съответно 80, 80, 78 и 76%. Въпреки това, последователности, хомоложни на транспозазните гени, не са открити надолу или нагоре по веригата на gtfB, gtfC и gtfD в Str. Mutans

(A) Геномно местоположение на местоположението на gtf гена. а) GTF 180 от Lcb. reuteri, (b) gtf Kg15 от Lcb. sakei, (c) gtfR от Str. oralis, (d) gtfB и gtfC от Str. mutans и (e) gtfD от Str. mutans (B) Транспозаза-хомоложна последователност надолу по веригата от gtfR. Регионът, ограден с пунктирана линия в A (c), е показан подробно в B. FR00720602 и AE007317 са номерът за присъединяване на NCBI на генома Str. Oralis Uo5 и Str. Pneumoniae R6, съответно. Числото след номера за присъединяване показва местоположението в генома.

Изображение в пълен размер

Филогенетичен анализ на каталитичния домен в стрептококови GTF

Филогенетични дървета, базирани на гена, кодиращ каталитичния регион (А), изведената аминокиселинна последователност на каталитичния регион (В), гена, кодиращ първата единица на свързващия глюкан регион, изграден от 6 повтарящи се единици директно (С) и Дедуцираната аминокиселинна последователност на първата единица от свързващия глюкан регион е конструирана по метода на съседно свързване (NJ). В А и В семейството на стрептококови gtf гени може да бъде класифицирано в 3 групи: водоразтворимата група за синтезиране на глюкан (WSG), водоразтворимата група за синтезиране на глюкан (WIG) и междинната група (INT). В D GTF от един и същи или тясно свързани видове могат да бъдат разделени в една и съща група. Стойността във всеки клон е прогнозната граница на доверие (изразена като процент) за позицията на клоновете, определена от анализа на началната лента. Показват се само стойности над 50%. Мащабната лента (разстояние [NJ]) представлява разлика от 5% в нуклеотидната последователност.

Изображение в пълен размер

Таблица в пълен размер

По-нататъшен анализ на стрептококови GTF каталитични домейни с помощта на BLAST търсене показа, че тези региони са хомоложни на α-амилаза, но не и на захараза. При blastp анализ на каталитичния домен на Str. Mutans GTFB, стойността на Е за каталитичния домен на α-амилаза е 8.25e-03. Това откритие предполага, че каталитичните области на стрептококови GTF не са филогенетично свързани със захаразата, въпреки че имат същата функция.

Филогенетичен анализ на свързващия глюкан домен в стрептококови GTF

Дискусия

Може да изглежда вероятно, че ензимите от семейството на гликозил хидролазата 70 са произведени от комбинация на захараза и глюкан-свързващи протеини, като Gbp от Str. Mutans. GTF са хомоложни на α-амилаза, но не и на захараза. По-нататък тези анализи показват, че регионите за свързване на глюкан са класифицирани като CW_binding 1, включително 1,4-β-N-ацетилмурамидаза и N-ацетилмурамоил-1-аланин амидаза. Тези открития предполагат, че общият предшественик на ензимите от семейство гликозил хидролаза 70 ще бъде ензимна група, чиято обща функция е захарната хидролиза и свързването на захарната верига. В допълнение, глюкан-свързващи протеини, като Gbp, са открити в Str. Mutans само в настоящата база данни. Поради тази причина се предполага, че Gbp, един от факторите на вирулентност, който позволява прилепване към зъбната повърхност, е произведен за първи път поради липсата на първата половина на глюкозилтрансфераза в Str. Mutans

Тук показахме, че ензимите в горната част на филогенетичното дърво синтезират глюкани с различни видове връзки, като α-1, 3; а-1,6; а-1,2; и α-1, 4, докато тези в долната част на дървото синтезират само водоразтворими глюкани, свързани с α-1, 6 (фиг. 1 и допълнителна таблица S1). Предишни проучвания показват, че стрептококът GTF произвежда разтворими глюкани в резултат на изместване на аминокиселини в каталитичния домен и/или намаляване на броя на повтарящите се единици в свързващия глюкан домен 24, 25. Следователно се предполага, че стрептококовият GTF е еволюирал, за да синтезира водоразтворими глюкани и че способността да се синтезират неразтворими във вода глюкани ще бъде придобита само ако чертата на предците е силно запазена и силно специализирана.

Както е показано на Фигура 3А и В и Таблица 1, както gtfB, така и gtfC принадлежат към групата WIG и се свързват помежду си във филогенетичното дърво, като ги разделя само кратко разстояние от 0,144. gtfC вероятно се репликира след gtfB, тъй като филогенетичните разстояния между 2 гена и корена са съответно 0,560 и 0,539. За разлика от тях, gtfB и gtfD са разделени на отделни групи, а филогенетичното разстояние между тях е относително високо (0,397). Следователно е вероятно тези 2 гена да са придобити поотделно; обаче, сходните филогенетични разстояния между тези гени и корена (gtfB, 0.539; gtfD, 0.537) предполагат, че те са били придобити в сходни моменти от време.

Родът Streptococcus придоби gtf гена чрез хоризонтален трансфер на гени, когато откри млечнокисели бактерии, като Lactobacillus и Leuconostoc, в човешката устна кухина. Това събитие съвпадна с въвеждането на ферментирали храни в човешката диета, което се случи поради развитието на земеделските практики и методите за консервиране на храни.

Изображение в пълен размер

В това проучване ние предполагаме, че основните причини за появата на зъбен кариес са били не само антропологични, но и бактериологични, т.е. генетични събития, довели до еволюцията на кариогенния Str. mutans Ето защо препоръчваме да се възприеме подход за молекулярна биология, като PCR-базирано откриване на gtf 30 гени, за бъдещи антропологични и археологически изследвания. Това би позволило по-точно разграничаване на кариеса и износването на зъбите, както и анализ на историческото разрастване на ул. Мутанс

Методи

Гликозил хидролазна фамилия 70 последователности

ДНК и аминокиселинните последователности на гликозил хидролазна фамилия 70 протеини, използвани в това проучване, са получени от GenBank при NCBI (//www.ncbi.nlm.nih.gov/) с препратка към Pfam (// pfam. Sanger.ac . Великобритания /). Анализи на секвениране на неизвестни стрептококови gtf гени бяха извършени, както е описано по-рано 18, 30, и последователностите бяха депозирани в Японската ДНК Банка с данни (//sakura.ddbj.nig.ac.jp/sakura_en.html). Анализирахме 20 GTF от Streptococcus; 2 GTF, 9 декстран сукрази и 1 алтернан захараза от Leuconostoc; 10 глюкан сукрази от Lactobacillus; и 2 GTF от Lactococcus. Номерата за присъединяване на NCBI на тези GTF са представени на фигура 1 и допълнителна таблица S1.

Търсете хомология и семейство протеини

GTF мотивите бяха анализирани чрез търсене на семейства протеини и хомология, използвайки BLAST в NCBI и база данни за семейство протеини SYSTERS в Института за молекулярна генетика Макс Планк, изчислителна молекулярна биология (//systers.molgen.mpg.de/), съответно.

Филогенетичен анализ

Изравняването на последователността беше извършено със софтуера ClustalX версия 1.83 31 (//bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/#G). Множество файлове за подравняване, запазени от ClustalX във формат Clustal (* .aln), бяха преобразувани във формат MEGA (* .meg), използвайки софтуер MEGA версия 5 32 (//www.megasoftware.net/). Филогенетичният анализ беше извършен чрез NJ, ME и MP методи, използвайки софтуер MEGA версия 5. Филогенетичните разстояния бяха изчислени по NJ метод, използвайки същия софтуер. Съответният параметър на NJ алгоритъма беше настроен на „пълно елиминиране“ и бяха използвани моделът „нуклеотид: разстояние p“ и „методът за зареждане“. Средното междупопулационно еволюционно разнообразие на последователностите, които кодират каталитичния домейн на GTF между Streptococcus, Leukonostoc и Lactobacillus, също е изчислено с MEGA 5. В този модел са използвани "методът на пълен старт" и "методът на стартиране". "Разстояние p" модел. анализ.

Картографиране на геномното местоположение на гените от семейство гликозил хидролаза 70

Местоположението на гените, кодиращи протеините от семейството на гликозил хидролазата 70 от Str. Mutans, Lcb. reuteri и Lcb. Sakei са получени с помощта на инструмента за търсене на анотации в изчерпателния микробен ресурс на института J. Craig Venter (//www.jcvi.org/) или чрез позоваване на предишни доклади 17, 33. Последователностите нагоре и надолу по веригата на гена Str gtfR. Геномът на Uo5 oralis (GenBank: FR720602.1) беше анализиран с помощта на BLAST (NCBI; //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Допълнителна информация

PDF файлове

Допълнителна информация

Допълнителни таблици S1 и фигура S1

Код за достъп: данните за ул. sanguinis gtfP са депозирани в базата данни GenBank с код за достъп AB252650.

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки. Ако откриете нещо злоупотребяващо или което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, маркирайте го като неподходящо.