Parasitol Latinoam 62: 79-82, 2007 FLAP

КОМУНИКАЦИИ

Метод за култивиране на мухи от ларви Lucilia sericata за терапия с ларви

МЕТОД НА КУЛТУРА ЗА Lucilia sericata ЛЕТЕТЕ ЛАРВИ ЗА ИЗПОЛЗВАНЕ В МАГОГОВА ТЕРАПИЯ

LUIS FIGUEROA *, JORDANA FLORES * и SANDRA RODRÍGUEZ *

* Институт по паразитология, Медицински факултет, Austral University of Chile. Кампус Isla Teja. Валдивия. Каре 567. Телефон: 63-221499. Факс: 63-214475.

Общите цели на изследването бяха: 1) Опишете цикъла на развитие на Lucilia sericata (Calliphoridae), в техните яйцеклетки, ларви, кукли и имаго и 2) Адаптиране на техника за дезинфекция на новите L. sericata и последващото получаване на стерилни ларви. Контролът на развитието се извършва чрез ежедневно определяне на различните му етапи. За техниката на дезинфекция яйцата бяха потопени последователно в разтвори на 0,5% натриев хипохлорит и 10% формалин и след това измити в 0,15 М NaCl. кръв и обикновен бульон.

Разработването на L. sericata в лабораторията той показа, че яйцеклетките и излюпването им в ларви са настъпили (средно ± стандартно отклонение) при 15 ± 3,5 часа, докато от ларви до какавиди 138 ± 17 часа и от какавиди при възрастни 126 ± 21 часа. Техниката на дезинфекция на яйцата на L. sericata показа 87% ефективност.

Общите цели на настоящото проучване бяха; 1) Опишете цикъла на развитие на Lucilia sericata (Calliphoridae) през етапите на яйцеклетката, ларвата, какавидата и имаго и 2) Разработване на метод за дезинфекция на яйцата на L. sericata. Процесът на развитие на тази муха се наблюдава ежедневно, определяйки времената, необходими за появата на всеки различен етап. Техниката на дезинфекция включва последователно третиране на яйцата в разтвори на 0,5% натриев хипохлорит и 10% формалин, след като яйцата са получени от експериментално кръстосване на мъжки и женски мухи в лабораторията. След това яйцата се изплакват в стерилни 0,15 MNaCl и пробите от яйца се разстилат върху соев агар от триптиказа, съдържащ 5% овча кръв, и също се инокулират в хранителен бульон. L. sericata се излюпва след 15 ± 3,5 часа, произвеждайки какавиди след 138 ± 17 часа, а възрастните се появяват след 126 ± 21 часа. Техниката на дезинфекция, използвана в настоящото проучване, е била 87% ефективна. Стигна се до заключението, че цялостното разработване, както и дезинфекцията на яйцата, може да се извърши успешно в лабораторията за производство на ларви, полезни при терапия с личинки.

Ключови думи: Lucilia sericata, терапия с личинки, муха, Чили.

ВЪВЕДЕНИЕ

Терапията с ларви премахва некротичната тъкан, насърчава растежа на тъканите и подобрява скоростта на зарастване. Мухите, които най-често се използват в терапията с ларви, са тези, принадлежащи към семейство Calliphoridae, които споделят няколко изгодни биологични свойства 1 .

От тази група видовете, с които работим, са Lucilia sericata гъли, които се хранят с навик, и един от преобладаващите видове в трупната фауна 1011. Те са космополитни и се срещат по-често през летните месеци 23 .

L. sericata Това е средно голяма муха, лесно разпознаваема по металния цвят на тялото си (зелен), особено по корема 4 .

Развъждането на тези духове е технически просто. За правилното му управление е необходимо да се знае еволюционният цикъл на вида, както и нуждите му от храна, температура и влажност 5 .

В нашата среда опитът с този тип лечение е почти непознат и много малко ценен поради предразсъдъчни културни проблеми, които ни карат да игнорираме положителните аспекти на този тип алтернативни терапии.

Целта на това проучване е да допринесе за познаването на терапията с ларви, както и за биологичния цикъл на L. sericata, и демонстрират, че е възможно да се възпроизведе този цикъл в лабораторията, за да се получат дезинфекцирани яйца.

МАТЕРИАЛ И МЕТОД

Ferreira 6 капана бяха използвани за събиране на мухите. Използван е буркан с диаметър 150 mm и височина 200 mm с черен цвят. В периферията на основата са направени 12 отвора с диаметър 13 мм, разположени в кръгове (през които са влизали мухите). В дъното на буркана беше поставен пластмасов съд за стръвта. На върха на тази тенджера имаше конус, който имаше основен диаметър 150 mm и горен отвор с диаметър 35 mm. Пластмасова торбичка (в която бяха заклещените мухи) беше поставена над горния отвор на буркана. (Фигура 1). Капаните бяха окачени на 1 метър от земята, в зони, изложени на слънце. Видовете и останките от риба са използвани като стръв. За класификацията бяха използвани вече установени таксономични ключове 7 .

Клетките са построени с телени кубчета с размери 500 х 500 х 500 мм, покрити с мрежа против комари. От едната страна е поставен лек втулен материал, достатъчно дълъг, за да работи вътре. В долната част на клетката има поднос с вода, за да се поддържа влажността и да се избегне излишъкът на алергенни материали, изпуснати в околната среда.

При храненето на мухите се използва гранулирана захар и сухо мляко (като източник на протеин), подредени в кладенци. Обърната чаша вода върху чаша на Петри с абсорбираща хартиена кърпа осигурява вода, без да бъде покрита от гъбички.

Парчета черен дроб, поставени на дъното на тъмни PVC тръби, осигуряват субстрат, в който мухите снасят яйцата си. По този начин беше предложена тъмна и защитена среда и лесна за работа за събирането му. Яйцата се събират всеки ден 8 .

Средно всяка от четирите клетки съдържа 500-1000 мухи. Мухите бяха добавяни в клетките всяка седмица, за да се заселят отново 8 .

Камерата за култура на ларвите е направена с пластмасови саксии с херметичен капак. В центъра на капака беше изрязано пространство, което беше покрито с тънка кърпа, която позволяваше кислород. Саксията е наполовина напълнена с фини стърготини. Вътре парче черен дроб служи като субстрат, върху който се отлагат наскоро снесените от мухите яйца. Когато ларвите се излюпят, те поглъщат черния дроб и преминават през трите си етапа на ларвите, преди да влязат в дървените стърготини, за да окуклят. Възрастните излизат след какавидите и саксиите се оставят в клетките, за да се увеличи популацията им 8. За да се определят времената в развитието на еволюционния цикъл на L. sericata Разработката е възпроизведена 8 пъти, като се извършва ежедневен контрол, определящ различните й етапи.

lucilia

Фигура 1. Капан за мухи.

Във връзка с дезинфекцията на ларвите те се раждат стерилни, когато яйцата са дезинфекцирани и поставени в стерилен контейнер. Женските снасят яйцата в маси заедно със свързващо вещество, така че те трябва да бъдат разделени, преди да бъдат дезинфекцирани чрез накисване в някакъв вид детергент, като натриев сулфат или натриев хипохлорит 8 .

В нашата работа дезинфекцията е следвала техника, вече установена през 1998 г. 9. Най-добрият резултат беше получен чрез изплакване и разклащане с търговски натриев хипохлорит, разреден на 0,5%, за да се дисоциират яйцата и след това стерилизация за 5 минути с 10% формалин. накрая бяха извършени 3 до 4 изплаквания със стерилен физиологичен разтвор. Целият този етап се провежда в стерилно поле при основни асептични мерки.

Стерилността на яйцата е осигурена чрез култивирането им при 27 ° C върху триптиказен соев агар и кръвен агар като взаимозаменяеми, в допълнение към обикновения бульон. Развитието на бактериите или замърсяването на гъбичките се контролира след 24 - 48 часа. В допълнение, при всяка стерилизация, яйцата се култивират в триптозен бульон, това се дължи на факта, че всяка индикация за замърсяване чрез мътност е лесно откриваема и по този начин се елиминират онези ларви, които са били замърсени.

Извършени са 100 контроли на процеса на дезинтеграция и дезинфекция на яйцата, като се измерва процентът на стерилни живи ларви при 48 часа инкубация.

Определено е времето, през което жизнеспособните стерилни ларви могат да се съхраняват при 4 o C.

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

Определянето на вида L. sericata За изучаването и развитието на метод за размножаване и размножаване той се основава на неговия космополитен характер и на успешния опит на други автори, демонстрирайки ефективността му при почистване на рани 1 .

За да определим времето, необходимо за развитието на цикъла, извършваме ежедневен контрол, определящ различните му етапи (възпроизведохме изцяло жизнения цикъл на L. sericata) Получавайки в резултат, че мухите след копулиране поставят яйцата си директно в източника на храна, където се е излюпило в ларви (средно ± стандартно отклонение) на 15 ± 3,5 часа, докато от стадия на ларвите до какавидите е имало 138 ± 17 часа и от какавиди до възрастни, 126 ± 21 часа. Данни, които са съгласни с автор 13. Всичко това зависи от променливата температура и наличността на вода и храна.

В условията на нашата лаборатория: Температура от 25 ° C, приблизително 50% влажност, поддържане на храна и вода постоянно, развитието на биологичния цикъл на L. sericata от яйце до имаго е 11,6 дни.

Яйцата се изваждаха от клетките ежедневно, пренаселването на клетката се извършваше ежеседмично, за да се възстановят изгубените екземпляри и да се поддържат мухите винаги в най-високия им период на продуктивност, който е между втората и четвъртата седмица от живота 8 .

При разпадането на яйцата от тяхното свързващо вещество, най-добри резултати бяха получени чрез потапяне за 3 минути в 0,5 Na хипохлорит и след това дезинфекция в 10% формалин за 5 минути с постоянно разбъркване.

Много е важно яйцата да се измиват със стерилни 0,15 М NaCl, след всяка от тези стъпки. В този случай бяха извършени 3 до 4 измивания.

За да проверим дали процесът на дезинфекция е бил успешен, на базата на вече предложеното 8 проведохме 100 теста за дезинфекция и контрол на качеството, използвайки соев агар трипиказа, добавен или не с 5% кръв, това е благоприятна среда за яйцето и неговото излюпване в ларви, тъй като тя може да се храни с нея, освен че ни позволява да видим дали има някакъв вид замърсяване. Освен това във всяка култура от яйца се използва бульон от триптоза, за да се открие замърсяване чрез мътността на средата. Срокът за определяне на успеха на дезинфекцията е от 24 до 48 часа, ако след този период не е имало замърсяване, бихме могли да осигурим стерилността на средата и следователно на ларвите, като по този начин проверяваме дали е възможно да се използват при ларвите терапия.

След като процесът на дезинфекция беше извършен, определянето на процента на живите ларви беше извършено чрез оценка на количеството яйца, положени върху плочата на агара, които останаха живи след 48 часа. Получават се 4% от живите ларви, които остават дезинфекцирани само до 24 часа инкубация, 87%, които остават дезинфекцирани повече от 48 часа и само 9% от 100-те проведени контроли не са без патогенни микроби. (Инкубационната температура беше 26 ° - 28 ° C).

Друг елемент, необходим за определяне, е времето, през което жизнеспособните стерилни ларви могат да бъдат запазени. Както е посочено 8, ларвите могат да бъдат в хладилник до 5 дни при 4 o C, тъй като след това време смъртта на ларвите надвишава 50%. 10 проби бяха разделени на случаен принцип (като се вземе предвид, че те бяха дезинфекцирани след 48 часа инкубация) от 100-те проведени контроли и доведени до 4 ° С за 5 дни. Впоследствие те бяха прехвърлени в детската стая при 25 ° C с парче говежди черен дроб, за да се определи неговата жизнеспособност. За няколко часа ларвите възстановиха пълната си активност и започнаха да поглъщат храната, което им позволи да достигнат състоянието на имаго и ни дават сигурност, че дезинфекцираните ларви могат да се съхраняват в хладилник максимум 5 дни, тъй като след тази жизнеспособност се губи с голям процент.

ПРЕПРАТКИ

1 SHERMAN RA, HALL M J R, THOMAS S. Лечебни личинки: Древно лекарство за някои съвременни страдания. Ann Rev Entomol 2000; 45: 55-81. [Връзки]

2 SHINKMAN R. Червеи, пиявиците се завръщат в съвременната медицина. Mod Healthcare 2000; 20: 54-5. [Връзки]

3 GUIMARÁES J H, PAPAVERO N, PRADO P. As miíases na regiáo Neotropical (Идентификация, биология, библиография). Revta Bras Zool 1983; 1: 239-416. [Връзки]

4 KETTLE DS. Медицинска и ветеринарна ентомология. Второ издание. Катедра по ентомология. Университет в Куинсланд. Австралия 1995: 53. [Връзки]

5 SHERMAN R A, WYLE AF. Нискотарифно отглеждане на личинки в болници, клиники и училища. Am J Med HYG 1996; 54: 38-41. [Връзки]

6 GUIMARÁES J H, PAPAVERO N, PRADO P. As miíases na regiáo Neotropical (Идентификация, биология, библиография). Revta Bras Zool 1983; 1: 239-416. [Връзки]

7 GREENBERG B. Мухи и болести. Екология, класификация и биотична асоциация. САЩ: Princeton University Press 1971; Том I: 1-856. [Връзки]

8 SHERMAN R A, WYLE A F. Нискотарифно отглеждане на червеи в болнични клиники и училища. Am J Med HYG 1996; 54: 38-41. [Връзки]

9 MUMCUOGLU K Y, INGBER A, GILEAD L, et al. Терапия с личинки за лечение на диабетни язви на краката. Diab Care 1998; 21: 2030-1. [Връзки]

10 FIGUEROA L, LINHARES A. Синантропия на Calliphoridae (Diptera) от Валдивия. Чили. Neotropica Entomol 2002; 31 (2): 233-9. [Връзки]

11 ATIAS A. Медицинска паразитология. Факултет по медицина Университет в Чили 1999; 450-64. [Връзки]

Работа, финансирана от Дирекцията за изследвания и развитие на Австралийския университет в Чили (проект DID: S-2003-55).

Кореспонденция на: e-mail: [email protected]

Цялото съдържание на това списание, с изключение на случаите, когато е идентифицирано, е под лиценз Creative Commons

Сантяго 1, Чили

Тел.: 56-2- 9785500


[email protected]