Субекти

Обобщение

Въведение

Затлъстяването е прекомерното съхранение на мазнини в тялото, което е важен компонент на метаболитния синдром, съзвездие от хипертония, диабет, дислипидемия и мастна чернодробна болест, което увеличава риска от сърдечно-съдови заболявания 11. Въпреки че е широко прието, че SFA като група насърчава коремното затлъстяване, дислипидемия, инсулинова резистентност, нарушен глюкозен толеранс и системно възпаление, 12 тази роля на SFA при затлъстяване, диабет и сърдечно-съдови заболявания се оспорва. Последните проучвания показват, че отговорите, индуцирани от SFA, зависят от дължината на веригата, с ясни разлики в биологичните реакции между лауринова киселина и палмитинова киселина 13. Ролите на SFA в индивидуалната диета при OA обаче не са ясно определени.

Нашите предишни проучвания съобщават, че в продължение на 16 седмици при млади мъжки плъхове Wistar диетата с високо съдържание на въглехидрати и мазнини (H, съдържаща предимно фруктоза и говежди лой) имитира симптомите на човешкия метаболитен синдром, включително коремно затлъстяване, увеличена обща телесна мазнина, повишени плазмени липиди и кръвно налягане, нарушен глюкозен толеранс и инсулинова чувствителност, мастно чернодробно и сърдечносъдово ремоделиране Настоящото проучване изследва ролята на SFA от C12 до C18 (лауринова киселина (LA; C12: 0), миристинова киселина (MA; C14: 0), палмитинова киселина (PA; C16: 0) и стеаринова киселина (SA; C18: 0), както и телешки лой (главно транс-мастни киселини и транс-мастни киселини) както в признаците на метаболитен синдром, така и в развитието на ОА.

Резултати

SFA при метаболитен синдром

Плъховете, на които се прилага високо въглехидратна диета, заедно с телешки лой, съдържащ както наситени, така и транс мазнини (диета Н), развиват промени, свързани с метаболитния синдром на човека, включително коремно затлъстяване, хиперлептинемия, хиперлипидемия и чернодробна дисфункция в сравнение с диета с царевично нишесте (диета С) ( Таблица 1), обаче, плъховете Н не показват хипергликемия и хиперинсулинемия в сравнение с плъхове C. Диета С има ниска енергийна плътност и вероятно поради тази причина приемът на храна е бил по-висок при плъховете С, отколкото при всички останали групи. Въпреки че приемът на храна е бил по-висок при плъховете С, приемът на енергия е бил по-висок във всички групи с високо съдържание на мазнини, отколкото при плъховете С в реда на

метаболитен

( ДА СЕ ) 3-D изображение на пълни коленни стави на плъхове и реконструирани аксиални микро КТ (вложка) изображения на напречното сечение на интересуващия регион, т.е. медиалното и страничното плато на тибията, показващо променена субхондрална костна архитектура (жълтите стрелки показват анормални костни) морфологични промени . За морфометрични анализи, ( Б. ) Фракцията от костния обем (BV/TV) се изчислява като съотношението на сегментирания костен обем (BV) към общия обем (TV) на региона от интерес. Какво още, ( ° С ), също беше изчислена костната минерална плътност (КМП) на региона от интерес. Всички стойности са представени като средна стойност ± SD (P 2 (Avg.OS.L), увеличена при плъхове H, HPA и HSA в сравнение с плъхове C, което предполага засилено костно ремоделиране и нерегулиран минерален метаболизъм, причинен от диети The Avg.OS. L плътността на плъховете HLA и HMA е много подобна на тази на плъховете C. Намаленото присъствие на средното ядро ​​на остеоцитите (Ср. OS.N) в плъховете H, HMA, HPA и HSA в сравнение с плъховете С предполага, че диетите индуцират апоптотична смърт на остеоцитите (допълнителна таблица 2).

SFA в човешки хондроцити и експланти на говежди хрущял

( ДА СЕ ) КОНСЕРВА, ( Б. ) COL10A, ( ° С ) MMP13, ( д ) ADAMTS4, ( И ) ADAMTS5 и ( F ) Нивата на иРНК RUNX2 бяха оценени чрез RT-PCR както при пациенти без IL-1β, така и в IL-1β пелети.Всички експериментални проби бяха проведени в три екземпляра. Всички стойности са представени като средна стойност ± SD (P

Ограниченията на това проучване включват, че не сме измервали синовиални морфологични промени или промени в концентрациите на цитокини в синовиалната течност. Тези два допълнителни параметъра могат да допринесат с допълнителна информация за разбиране на местните промени, дължащи се на възпаление в диетите на AGS и по този начин да подобрят разбирането на индуцираното от затлъстяването ОА.

В заключение, това проучване предоставя доказателства, че SFA може да доведе до подобни промени както в метаболитния синдром, така и в OA. Тези промени корелират с плазмените концентрации на лептин и инсулин, участващи в затлъстяването, диабет тип 2 и ОА. Нашите данни показват, че заместването на традиционните диети, съдържащи LA, произведено от кокосово орех, с PA, получено от палмово масло или SA от животински мазнини, може да влоши развитието на метаболитен синдром и OA. Освен това са необходими клинични изпитвания при хора, за да се определи дали заместването на PA и SA в диетата с LA ще отслаби или обърне развитието на OA и метаболитен синдром, особено затлъстяване и хипертония.

Методи

Проучване на дизайна и диети.

Измервания на метаболитни променливи.

Извършвани са ежедневни измервания на телесното тегло и приема на храна и вода, за да се наблюдава ежедневното здраве на плъховете. Ефективността на преобразуване на захранването (%) се изчислява, както е описано по-горе [14]. Процентът на наддаване на телесно тегло в продължение на 16 седмици се изчислява като разлика в телесното тегло между ден 0 и ден 112. Коремната обиколка се измерва на всеки 4 седмици с помощта на стандартна измервателна лента под лека анестезия със Zoletil (плоттамин 10 mg/kg, золазепам 10 mg/kg ip); Virbac, Peakhurst, NSW, Австралия).

Плъховете бяха евтаназирани след 16 седмици с Lethabarb® (100 mg/kg натриев пентобарбитон, ip). След евтаназия се събира кръв за изолиране на плазмата и плазмата се съхранява при -20 ° C преди по-нататъшен анализ. Сърцата бяха изолирани, за да подготвят сърцето на Лангендорф за измерване на постоянна диастолна скованост. След това тъкани като черен дроб, лява камера (с преграда), дясна камера и коремни мастни накладки (включително ретроперитонеална, епидидимисна и оментална) бяха отстранени за претегляне и изразени като mg/mm дължина на пищяла. Плазмените концентрации на лептин, инсулин, общ холестерол, триглицериди и нестерифицирани мастни киселини (NEFA) бяха измерени, както е описано по-рано [14] .

Оценка на ставния хрущял.

Анализ за апоптоза на TUNEL

Терминалната дезоксинуклеотидил трансфераза (TdT) dUTP Nick-End маркиране (TUNEL) се използва за идентифициране на клетки, които показват разграждане на тяхната ДНК по време на апоптоза. Първи тъканните резени бяха проникнати с протеиназа К в продължение на 30 минути при 37 ° С. Слайдовете бяха измити с PBS и анализът беше извършен, използвайки протокола на производителя (Roche, Германия). Срезите бяха инкубирани с DNase1 в продължение на 10 минути при стайна температура като положителен контрол. За анализ на полуколичествени данни положителните клетки от различни полета за наблюдение бяха преброени и нормализирани до броя на клетките на 100 общо клетки във всяка група, като се използва ImageJ (NIH, Bethesda, MD) 39 .

Оценка на субхондралните костни промени.

Извършен е микро-КТ за анализ на субхондралните костни промени. Бедрената кост и пищяла са сканирани с помощта на микро-CT (Scanco μCT 40, Scanco Medical, Швейцария) с изотропен размер на воксела 18 μm с напрежение 55 kV и ток 145 μA с алуминиев филтър 0, 5 mm . Времето на експозиция е 1180 ms и вграденият софтуер на Scanco е използван за сегментиране на набора от данни 39. Ръчни зони на интерес (ROI) са начертани около анатомичния контур в субхондралната костна област на медиалното и страничното плато на тибията. Обемът на лихвите (VOI) се състои от стек на ROI (25 раздела). VOI започва под субхондралната плоча, простираща се дистално към растежната плоча. Изчислена е връзката между костния обем и общия обем (BV/TV) и костната минерална плътност (BMD) от VOI.

Анализ на остеоцитите.

Средната стойност на празните лакуни на остеоцитите (Avg OS.L) и средното ядро ​​на остеоцитите (Avg OS.N) се отчитат на единица площ (mm 2) в областта на субхондралната кост на медиалното плато на тибията с помощта на ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Лечение на хондроцити и хрущялни експланти със SFA

Подготовка на ДФЗ

LA, MA, PA и SA са закупени в търговската мрежа с най-високата налична чистота (Sigma-Aldrich, GC пречистена, химически синтезирана). Като носител е избран говежди серумен албумин (BSA) (без мастни киселини, Sigma Aldrich). Комплексните разтвори на SFA-BSA бяха извършени с помощта на описания по-рано протокол [6]. Отделните SFA се разтварят в 100% етанол при 70 ° С, за да се получи 200 mM основен разтвор. След това основният разтвор се разрежда 1:10 в 10% (w/v) BSA, направен с модифицирана среда на орел на Dulbecco (DMEM) за 10 минути при 55 ° C. Полученият разтвор на SFA (20 mM) се филтрира стерилен (0.45 µM филтър ) преди прилагане върху клетъчни култури, като се използва предварително описан протокол [6]. Контролът на носителя (отрицателен контрол) е BSA без мастни киселини със същата концентрация на етанол.

Хондроцитна култура и говежди експланти.

Хондроцитите бяха събрани с помощта на ензимно храносмилане и култивирани с помощта на нашите публикувани протоколи 39. Накратко, биопсии на ставния хрущял са получени от първични пациенти с ОА, подложени на операция за подмяна на коляното в болница „Принс Чарлз“ (Бризбейн, QLD, Австралия). Всички биопсии на хрущяла са взети от част от повърхността на бедрената кондила, за която хирургът смята, че прилича на непокътнат и здрав хрущял. Петимата дарители са мъже на възраст между 60 и 65 години и всички са предоставили писмено информирано съгласие. Изследването е одобрено от болницата „Принс Чарлз“ и Комитетите по хуманна етика на Технологичния университет в Куинсланд. Всеки образец на хрущял беше допълнително охарактеризиран и оценен според оценката на Манкин, като за по-нататъшни експерименти бяха използвани само проби с оценки 0–1 (здрав хрущял).

Хрущялът се дисектира от костта и се смила с разтвор на колагеназа 2 (Invitrogen, Lakewood, NJ) в продължение на една нощ в хранителна среда DMEM за изолиране на хондроцитите на ставния хрущял (ACC). След разграждане, АСС (2,5 × 105 клетки) се гранулират чрез центрофугиране в 15 ml епруветки Falcon и се култивират в триизмерна (3D) система за култивиране на пелети 39 в продължение на 14 дни в хондрогенна среда в присъствието или отсъствието на различни SFA.

За проучвания на експлантата на говедата, в деня на клането са получени пресни коленни стави за възрастни говеда (n = 3). След това от колянните стави бяха взети експланти на ставния хрущял с пълна дебелина без субхондралната кост. След това хрущялните дискове бяха асептично дисектирани с помощта на 4-мм дермален удар. Дисковете се култивират в DMEM и се допълват с 10% фетален говежди серум (FBS) и антибиотици при 37 ° C с 5% CO 2 в продължение на 48 часа.

След това пелетите и дисковете бяха стимулирани с всеки SFA (крайна концентрация: 30 μg/ml, получена от MTT анализ - данните не са показани). Отрицателната контрола, в която не се добавя SFA, се третира само с BSA носител. За да се изследват ефектите на SFA и възпалителните цитокини, някои ACC пелети и говежди хрущялни дискове бяха третирани с IL-1β (10 ng/mL) в присъствието или отсъствието на различни SFA. След ден 3 и ден 7 средата се събира и съхранява при -80 ° C за количествено определяне на сулфатирани гликозаминогликани. Хрущялните дискове и ACC пелетите са обработени по-късно за хистологичен анализ и количествен PCR анализ в реално време (qPCR). За по-нататъшна оценка на отговорите на определени SFA, различни концентрации (10 μM, 30 μM, 60 μM и 90 μM) от PA и SA са добавени към пелети от хондроцити както в отсъствие, така и в присъствието на IL-1β (10 ng/ml ). След ден 3 и ден 7 средата се събира и съхранява при -80 ° C за количествено определяне на сулфатирани гликозаминогликани (sGAG). В допълнение, за да се оценят ефектите на IL-1β, използван в това проучване, хондроцитните пелети са третирани с различни концентрации на IL-1β (1-10 ng/ml). Средата за ден 3 и ден 7 се събират и съхраняват при -80 ° C за количествено определяне на sGAG.

Анализ на сулфатирани гликозаминогликани (sGAG)

За да се измери освобождаването на sGAG, супернатантите бяха събрани от ямките, съдържащи дискове на говежди хрущял или пелети от хондроцити, третирани със или без SFA на ден 3 и ден 7. SGAG беше измерен, използвайки метода на диметилметиленовото синьо (DMB) с комплекта (Blyscan ™, Biocolor Ltd) следвайки инструкциите на производителя. Зоната на изчерпване на sGAG в хрущялните експланти се определя с помощта на изображения на оцветяване на Safranin O и се измерва с помощта на ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Екстракция на РНК и PCR в реално време

Общата РНК се екстрахира с помощта на TRIzol реагент (Invitrogen), третира се с DNase и се пречиства съгласно протокола на производителя с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA беше синтезирана от 1 μg от общата РНК съгласно протокола на производителя, използвайки SensiFAST cDNA Synthesis Kit. Количествена PCR 41 в реално време, използвайки SYBR Green откриваща химия, беше извършена върху ABI 7500 PCR в реално време PCR (Applied Biosystems, Foster Сити, Калифорния, САЩ). Бяха проведени анализи на кривата на стопяване на всички PCR продукти в реално време и беше показано, че се получава единичен ДНК дуплекс. Всички проби бяха измерени в три екземпляра и средната стойност на всички експериментални проби беше взета за сравнителен анализ. Количествените измервания на всички праймери, използвани в това проучване, бяха определени с помощта на метода (2 -ΔΔ Ct) и 18 s и експресия на β-актин бяха използвани като вътрешен контрол, както е описано по-рано от нашата група 39, 41, 42, 43 .

Статистика

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на Graphpad Prism. Данните са представени като средно ± стандартно отклонение (SD) за всички променливи и са анализирани с ANOVA метод. За оценка на статистическата значимост е използван дисперсионен анализ с повтарящи се мерки с post hoc тестове (Dunnett's/Bonferroni). Нивото на значимост е определено на P