свързващият

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • HuR взаимодейства с XIAP IRES
  • HuR се свързва директно с IRES XIAP РНК
  • Клетъчните нива на HuR модулират активността на XIAP IRES
  • Клетъчните нива на HuR модулират транслацията на ендогенна XIAP иРНК
  • HuR-медиираната индукция на XIAP предпазва клетките от индуцирана от етопозид клетъчна смърт
  • Дискусия
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнителна фигура 1
  • Word документи
  • Допълнителна легенда за фигурата

Субекти

  • Клетъчна смърт
  • РНК-свързващи протеини
  • Превод

Обобщение

Експресията на вътрешния инхибитор на клетъчната каспаза XIAP се регулира главно на нивото на протеинов синтез. 5 'нетранслираният регион съдържа вътрешен мотив на място за влизане на рибозома (IRES), който поддържа независим от капаците транслация на XIAP иРНК по време на клетъчен стрес. В това проучване ние показваме, че РНК-свързващият протеин HuR, за който е известно, че организира антиапоптотична клетъчна програма, стимулира транслацията на XIAP иРНК чрез IRES XIAP. Освен това, ние показваме, че HuR се свързва с XIAP IRES in vitro и in vivo и стимулира набирането на XIAP иРНК в полизоми. Важно е, че защитата на индуциращия апоптозата агент етопозид чрез свръхекспресия на HuR изисква наличието на XIAP, което предполага, че медиираната от HuR цитопротекция се изпълнява частично чрез подобрена транслация на XIAP. Нашите данни показват, че XIAP принадлежи към HuR-регулирания РНК оперон на антиапоптотични гени, който заедно с Bcl-2, Mcl-1 и ProTα допринася за регулирането на клетъчното оцеляване.

Въведение

Х-свързаният инхибитор на апоптоза (XIAP) е прототипният член на инхибитора от семейството на апоптоза протеин. XIAP изпълнява няколко различни функции в клетката, включително модулация на медиирана от рецептора трансдукция на сигнала, убиквитинация на протеини и главно директно инхибиране на каспаза и по този начин регулиране на клетъчното оцеляване (прегледано в Liston et al., 2003; Dubrez-Daloz et al., 2008) Въпреки че не са описани мутации, които свързват XIAP с онкогенната трансформация, повишени нива на XIAP са докладвани при различни видове рак и са свързани с повишена резистентност към химиотерапия и радиация (Tamm et al., 2000, 2004a, 2004b; Holcik et al., 2000b; Yoon et al., 2006; Gu et al., 2009). Терапевтичният потенциал за насочване на експресията на XIAP наскоро беше демонстриран в няколко клинични проучвания (Schimmer et al., 2005, 2009; Dean et al., 2007, 2009).

Клетъчните нива на XIAP се регулират от няколко различни механизма, но преобладаващата регулация изглежда е на нивото на иницииране на транслацията (Holcik, 2003). 5 'нетранслираният регион (5' UTR) на иРНК на XIAP съдържа мотив на вътрешно място за влизане на рибозома (IRES), който задвижва ефективно транслация на иРНК на XIAP по време на клетъчен стрес, когато глобалната транслация зависи от капачката е нарушена (Holcik et al., 1999; Yoon et al., 2006; Gu et al., 2009). Задвижваният от IRES транслация на клетъчни иРНК наскоро се очерта като важен регулатор на селективния транслация, особено при условия на хипоксия, ендоплазмен стрес или серумен глад (Holcik et al., 2000a; Holcik and Sonenberg, 2005). Тези състояния често присъстват в тумори и много ракови клетки се нуждаят от медииран от IRES транслация на специфични иРНК за тяхното оцеляване (Braunstein et al., 2007; Silvera et al., 2009). Въпреки че е идентифицирана промяната от зависим транслация към IRES (Braunstein et al., 2007), точните механизми и кохорта клетъчни протеини, които допринасят за регулирането на IRES-зависимия транслация, са неясни.

XIAP IRES е с дължина 162 нуклеотида и образува отчетлива РНК структура (Baird et al., 2007). Преди това сме характеризирали последователността и структурните атрибути на XIAP IRES (Holcik et al., 1999; Baird et al., 2007) и сме започнали да изясняваме механизма, който регулира неговата активност. Ние и други идентифицирахме IRES фактори на действие (ITAF), клетъчни протеини, които специфично се свързват и регулират IRES XIAP. Интересното е, че въпреки че някои от тези фактори стимулират функцията XIAP IRES (Автоантигенът (Holcik и Korneluk, 2000); hnRNP C1/C2 (Holcik et al., 2003); mdm2 (Gu et al., 2009)), другите го правят така че потискане (hnRNP A1 (Lewis et al., 2007); PTB (Baird et al., 2007)). Въпреки това, естеството на IRES XIAP рибонуклеопротеиновия комплекс (RNP) и идентичността на всички ITAF XIAP остават неизвестни.

В тази работа използвахме IRES XIAP РНК РНК афинитетна хроматография, за да идентифицираме HuR като нов XIAP ITAF. Установихме, че HuR се свързва с XIAP IRES in vitro и е част от комплекс XIAP-IRES-RNP in vivo. Освен това, HuR стимулира транслацията на ендогенна XIAP иРНК, която допринася за запазването на клетъчната жизнеспособност в модел на клетъчна смърт, медиирана от етопозиди.

Резултати

HuR взаимодейства с XIAP IRES

Изображение в пълен размер

След това оценяваме дали ендогенният HuR се свързва с ендогенна XIAP иРНК в клетките. Ние имунопреципитирахме РНК-протеинови комплекси, използвайки HuR, IgG (отрицателен контрол) или TIA-1/TIAR (известен РНК-свързващ протеин) антитела от протеинови екстракти при условия, които запазваха РНК-протеиновите комплекси, както е описано по-горе (Lewis et al., 2007). РНК се изолира от тези имунопреципитати и се получава допълнителна ДНК (cDNA) чрез обратна транскрипция, последвано от PCR амплификация със специфични за последователността праймери, кодиращи XIAP и β-актин. Не успяхме да амплифицираме значително количество XIAP от IgG или TIA-1/TIAR имунопреципитация (Фигура 1в, платна 3 и 4). Въпреки това, имунопреципитацията с антитела срещу HuR съутаява XIAP иРНК (Фигура 1в, път 2), потвърждавайки, че ендогенният HuR се свързва с ендогенна XIAP иРНК в клетки in vivo. Не успяхме да амплифицираме изобилието на β-актинов транскрипт от нашите имунопреципитати с някое от антителата, което показва, че нашата ко-имунопреципитация на иРНК на XIAP е специфична. Въпреки че се съобщава, че HuR е свързан с транскрипция на β-актин (Dormoy-Raclet et al., 2007), не можахме да потвърдим тази връзка.

HuR се свързва директно с IRES XIAP РНК

HuR съдържа три мотива за разпознаване на РНК (RRM), от които RRM1 и RRM2 участват в свързването на РНК, докато RRM3 е необходим за съвместно събиране на HuR олигомери в РНК, но допринася минимално за свързването на РНК (Fialcowitz-White et al., 2007). Тествахме, използвайки експерименти с UV омрежване с мутанти на делеция на HuR (Mazroui et al., 2008), дали това е така и при свързването на HuR с IRES XIAP. Пречистените AP-HuR-GST (HuR с пълна дължина), AP-HuR (CP1) -GST (съдържащи RRM1 и RRM2) или AP-HuR (CP2) -GST (съдържащи RRM3) бяха инкубирани с XIAP, маркиран с [32 P] RNA IRES, последвано от UV омрежване и разделяне чрез SDS-PAGE. Открихме, че RRM1 и RRM2 са необходими за свързване на HuR към XIAP IRES (допълнителна фигура 1А), което показва, че механизмът на свързване на HuR към РНК на XIAP IRES е подобен на други целеви РНК на HuR. Освен това тествахме способността на тези конструкции за изтриване да модулират активността на XIAP IRES (вижте по-долу).

Клетъчните нива на HuR модулират активността на XIAP IRES

50% в активността на XIAP IRES в сравнение с контрола без заглушаване (Фигура 2b). Тези наблюдения предполагат, че HuR притежава ITAF стимулираща активност за IRIS XIAP. Алтернативно обяснение за нашите наблюдения може да бъде, че HuR влияе върху целостта на бицистронния репортерен РНК транскрипт, като по този начин променя съотношението на CAT към β-gal протеин. Следователно, ние определихме ефекта от модулацията на HuR нивата върху транскрипционната цялост на бицистронната РНК β-gal/(- 162)/CAT, използвайки количествена обратна транскриптаза-PCR, както беше описано по-горе (Holcik et al., 2005). Обща РНК се изолира от трансфектирани клетки и се допълва ДНК чрез обратна транскрипция. Количествената PCR беше извършена с използване на праймери, които усилват част от β-gal кодиращата област и част от CAT кодиращата област. Както е показано на Фигура 2в, съотношението на CAT и β-gal цистрони не е модифицирано в клетките, независимо от състоянието на експресията на HuR.

Изображение в пълен размер

Клетъчните нива на HuR модулират транслацията на ендогенна XIAP иРНК

Ние показахме, че HuR свързва и регулира положително активността на XIAP IRES. След това изследваме дали клетъчните нива на HuR влияят върху транслацията на ендогенна XIAP иРНК. Клетките HEK293T бяха временно трансфектирани с плазмид, експресиращ GFP или GFP-HuR, и ендогенните нива на XIAP бяха определени чрез Western blot анализ 24 часа след трансфекцията. Установихме, че свръхекспресията на GFP-HuR причинява ∼2-кратно увеличение на нивата на XIAP протеин в сравнение с контрола на GFP (Фигура 3а), без съпътстващо увеличение на нивата на иРНК на XIAP (Фигура 3b). В обратен експеримент, клетките HEK293T бяха трансфектирани с контролно siRNA насочване или без HuR заглушаване и нивата на XIAP протеин бяха определени 48 часа по-късно чрез Western blot анализ. Установихме, че намаляването на нивата на HuR от siRNA води до намаляване на

50% в нивата на XIAP протеин в сравнение с контрола без заглушаване (Фигура 3в), докато това не е оказало ефект върху нивата на иРНК на XIAP (Фигура 3b). Тези наблюдения са успоредни с това, което сме виждали с изграждането на репортера на XIAP IRES (Фигура 2), което предполага, че HuR е положителен регулатор на трансляцията на XIAP чрез модулиране на функцията XIAP IRES.

Изображение в пълен размер

За да се демонстрира допълнително, че HuR действително влияе върху транслацията на ендогенни XIAP иРНК, използвахме полизомно профилиране, за да изследваме връзката на XIAP иРНК с транслация на рибозома в свръхекспресиращи HuR клетки. Наблюдавахме, че свръхекспресията на HuR води до лека загуба на тежки полизоми и увеличаване на монозомите (Фигура 3d), което показва репресия на глобалния протеинов синтез. Това наблюдение беше доста изненадващо, тъй като не е известно, че HuR влияе върху общите темпове на протеинов синтез. Въпреки това, обратната транскриптаза-PCR амплификация на XIAP иРНК от отделни фракции показва, че въпреки намаляването на общия протеинов синтез, XIAP иРНК се набира в по-тежките полизоми в клетките, които свръхекспресират HuR, потвърждавайки, че транслацията на XIAP иРНК се засилва от HuR.

HuR-медиираната индукция на XIAP предпазва клетките от индуцирана от етопозид клетъчна смърт

Свръхекспресията на HuR предпазва клетките от индуцирана от етопозид клетъчна смърт по XIAP-зависим начин. Клетките HEK293T бяха трансфектирани обратно с не-заглушаващ контрол (CTRL) или siRNA, насочени към XIAP и 24 часа по-късно с плазмид, експресиращ GFP или GFP-HuR. На 24 часа след трансфекцията клетките се третират с посочените дози етопозид в продължение на 24 часа и клетъчната жизнеспособност се определя чрез анализ на Alamar blue. Средно ± sem (барове) от два независими експеримента, извършени в три екземпляра (* P